Векторы, используемые для клонирования ДНК

Основным изобретением, применяемым для доставки чужеродных генов в различные организмы являются векторы. Вектор – это молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться в клетках различных организмов и обеспечивать размножение (клонирование) и работу (экспрессию) встроенного в неё искусственно какого-либо гена. В английской литературе вектор принято обозначать словом vehicle, т. е. повозка.

Объединение разных генов в молекуле ДНК бесполезно, если вновь образованные рекомбинантные ДНК не будут реплицироваться в клетке-хозяине. Таким образом, если одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, то другая должна содержать информацию, для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Чтобы решить эту проблему, используют клонирующие векторы («вектор» от латинского vector - переносчик).

Клонирующие векторы должны иметь малый размер, хорошую проницаемость в клеточной мембране, способность размножаться в клетке реципиента, а также иметь такую область в молекуле ДНК, в которую можно встроить фрагмент чужеродной молекулы ДНК.

Плазмиды – небольшие внехромосомные кольцевые молекулы ДНК. Часто в плазмидах содержатся гены деградации ксенобиотиков, устойчивости к антибиотикам. У растений часто применяется Ti-плазмида Agrobakterium tumefaciens.

Наиболее распространёнными векторными молекулами, созданными самой природой, являются плазмиды, представляющие собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, самостоятельно живущие в цитоплазме бактерий. Они способны к автономной репликации, обладают генами устойчивости к антибиотикам, что позволяет легко обнаружить их присутствие в клетках. Плазмиды могут внедряться в хромосому клетки хозяина, а также имеют участки ДНК (сайты рестрикции) длядействия ряда рестриктаз, т. е. каждая такая рестриктаза может разрезать кольцо плазмидной ДНК и переводить её в линейное состояние. После этого линейную плазмиду можно легко соединить с фраг-

ментом ДНК другого вида с подходящими липкими концами.

Работа по использованию векторов началась с кольцевой плазмиды pSC101. Она несёт только один участок расщепления (сайт рестрикции) рестриктазойEcoRl и превращается под действием этого фермента из кольцевой в линейную молекулу, концы которой могут «слипаться» между собой или с любыми фрагментами другой ДНК, полученными под действием той же рестриктазы. Кроме того, она несёт ген устойчивости к антибиотику тетрациклину, а значит, легко обнаруживается в бактериях, если их растить в среде с этим антибиотиком. Эти свойства pSC101и были использованы для создания и клонирования первых гибридных (рекомбинантных) ДНК, которые были функционально активными, т. е. могли бы стабильно существовать в клетке и наделять (трансформировать) её новыми признаками.

Примером введения фрагмента чужеродной ДНК в плазмидный вектор pSC101с помощью рестриктазы EcoRl схематически показаны на рис. 8.10.

 

Риc. 8.10. Введение фрагмента рекомбинантной молекулы ДНК в плазмидный вектор pSC101 с помощью рестриктазы ЕсоRI, образующей “липкие концы”

В настоящее время наибольшее распространение получила плазмида pBR322, в связи с тем, что у неё оказалось больше участков, разрезаемых различными рестриктазами и, поэтому, с ней можно «сшивать» самые разные фрагменты ДНК.

Кроме того, у плазмиды pBR322 не один, а два маркера для селекции на бактериальных средах, поскольку помимо тетрациклина эта плазмида кодирует ещё устойчивость к ампициллину (рис. 8.11).

 

Рис. 8.11. Вектор pBR322.