Антитела, синтезируемые трансгенными растениями

Применение	Антиген	Тип антител	Растение	Уровень экспрессии
Онкология (рак кишечника, легких, опухоли эпителиального происхождения	Раково-эмбриональный антиген человека	Мышино-человеческие химерные антитела IgG1 (cT84.66), scFv T84.66, T84.66/G68	табак	1-12 мг/кг СВ*
scFvT84.66	пшеница	50-900 нг/г СВ
рис	1.5-29 мкг/г СВ
Нейтрализация вируса бешенства	Белок вируса бешенства	Моноклональные антитела mAb SO57	табак	3 мкг/г СВ 0.07% РБ
ИФА-диагностика	Антитела против человеческого IgG	C5-1 IgG	люцерна	0.13-1.0% РБ
Предотвращение зубного кариеса	Поверхностный антиген стрептококка SAI/II	Guy’s 13 IgG IgA/G sIgA/G	табак	200-500 мкг/г СВ 5-8% РБ
Терапия рака толстой кишки	Поверхностный антиген	CO-17 A IgG	Nicotiana benthamiana	Нет данных
Лечение герпеса типа 2	Белок вируса герпеса HSV-2	IgG, IgA, DigA или sIgA IgG1 Fab и F(ab′)2	рис, соя	Нет данных
Иммуноаффинная очистка рекомбинантного HBsAg	Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg)	scFv	табак	0.031%-0.22% РБ

*(РБ – растворимый белок; СВ – сырой вес)

Антитела, полученные в растениях, могут быть одними из первых фармакологических белков, нарабатываемых в промышленных масштабах. Во многих исследованиях антитела получают в семенах злаковых и бобовых растений, что дает преимущество при их долговременном хранении при обычной температуре без потери активности. В семенах ячменя содержание диагностических антител достигало 150 мг/г веса семян. Из многих бобовых только горох и соя используются в настоящее время в качестве продуцентов рекомбинантных белков. Хотя соя дает сравнительно небольшой урожай по сравнению с кукурузой и рисом, содержание белка в семенах сои очень высокое – свыше 40%. Описан синтез человеческих антител к вирусу генитального герпеса в листьях и семенах сои. Горох дает такой же урожай, как и соя и содержание белка в его семенах такое же, однако цена его выращивания на 50% выше. В горохе были экспрессированы одноцепочечные антитела. Одни из таких антител против ракового антигена синтезировались на низком уровне под контролем семяспецифичного легуминового А-промотора. Другие антитела экспрессировались под семенным промотором USP и их синтез достигал 2% от общего белка семян. Семяспецифичный промотор фасоли был использован для экспрессии одноцепочечных антител в Arabidopsis thaliana. По сравнению с промотором 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S), экспрессия под контролем которого составила до 1% от растворимого белка, промотор фасоли arc5-I дал выход антител до 36% от растворимого белка в семенах арабидопсиса, причем антитела сохраняли антиген-связывающую активность и аффинность.

Кроме того, антитела в растениях были получены методом агроинфильтрации, а также с использованием векторов на основе вирусов. Преимущества этих двух систем в том, что можно получить миллиграммы белка за несколько дней вместо нескольких месяцев, которые требуются для получения трансгенных либо транспластомных линий растений.

 

 

Практическое занятие №10

Тема: Создание и применение трансгенных животных

 

На протяжении тысячелетий человек создавал новые породы животных, совершенствуя методы традиционной селекции. Для получения улучшенных генетических линий подобным образом требуется проведение множества раундов скрещиваний и отбора, каждый раз используя в качестве производителей животных наилучшими характеристиками. В результате подобных манипуляций со временем можно получить более или менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Данная стратегия считается весьма успешной, однако она требует больших временны́х и материальных затрат. Кроме того, после того, как улучшенная генетическая линия получена, вводить новые признаки методом скрещиваний и отбора становится затруднительно, поскольку могут быть утеряны ранее приобретенные полезные признаки, а также приобретены «вредные» гены, ухудшающие породу. Для преодоления этих затруднений необходима абсолютно новая стратегия, каковая и была разработана в рамках генной инженерии.

Идея генетического изменения животных путём введения в их геном нужной человеку генетической информации была впервые реализована в 80-х годах ХХ столетия. С тех пор животные, чей геном был трансформирован, называются трансгенными, а сам процесс их получения называется трансгенной технологией или трансгенозом.

В общих чертах новые генетически трансформированные линии (породы) животных получают по следующей схеме, разработанной на мышах:

1) клонированный ген вводят в ядро оплодотворённой яйцеклетки;

2) трансформированные оплодотворённые яйцеклетки имплантируют в реципиентную женскую особь (успешное развитие эмбриона млекопитающих в иных условиях невозможно);

3) отбирают потомков, родившихся из имплантированных яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках;

4) скрещивают между собой трансгенных животных и получают новую генетическую линию.

Трансгенные технологии разрабатывались и совершенствовались на лабораторных мышах. Трансгенные мыши сыграли свою роль в исследовании возможности синтеза лекарственных веществ, а также в моделировании различных генетических болезней человека, что необходимо при выработке стратегий борьбы с этими заболеваниями.

Так, трансгенные мыши использовались при изучении секреции белка CFTR, нарушения в котором приводят к возникновению муковисцидоза. Муковисцидоз — это распространённая генетическая болезнь, поражающая в странах Европы одного из 2500 новорожденных. Болезнь возникает вследствие мутации в гене CF, кодирующем белок CFTR, который в норме служит каналом для ионов хлора, проходящих через клеточную мембрану. В результате блокирования этого потока в некоторых органах, особенно в лёгких и поджелудочной железе, начинает скапливаться слизь, которая становится источником тяжёлой бактериальной инфекции. Загустевшая слизь забивает протоки, нарушается нормальная работа органов и симптомы муковисцидоза усиливаются. Продолжительность жизни больных муковисцидозом в настоящее время составляет 25–30 лет. Для изучения действия белка CFTR необходимо получить его в достаточном количестве. Для этого были получены трансгенные линии мышей, несущих ген CF под контролем регуляторных последовательностей гена β-казеина — одного из белков молока. В результате, в молоке трансгенных мышей содержался белок CFTR в форме, позволяющей его экстракцию.

Кроме того, были разработаны «мышиные» модели таких генетических заболеваний человека, как болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, образование опухолей, гипертония, дисфункция эндокринной системы и многие другие.

Трансгенный крупный рогатый скот.Молочные железы крупного рогатого скота являются удобным «биореактором» для производства многих необходимых человеку веществ, прежде всего, белковой природы. Коровы-рекордсменки дают в год до 10 000 л молока с содержанием белка до 35 г/л. Таким образом, теоретически, стадо из 20 трансгенных коров в год может выдать столько белка С, используемого для предотвращения тромбообразования, что покроет всю потребность человечества в этом препарате. Одной трансгенной коровы достаточно для получения требуемого ежегодно количества фактора IX (фактора Кристмаса), который вводят больным гемофилией для повышения свертываемости крови.

return false">ссылка скрыта

Для создания трансгенных коров используется модифицированная схема трансгеноза мышей методом микроинъекций ДНК. Процедура включает следующие этапы:

1) Сбор ооцитов (яйцеклеток) коров, забитых на скотобойне.

2) Созревание ооцитов in vitro.

3) Оплодотворение бычьей спермой in vitro.

4) Центрифугирование оплодотворённых ооцитов для концентрирования желтка, который в нормальных яйцеклетках мешает визуализации мужского пронуклеуса[2] с помощью светового микроскопа.

5) Микроинъекция ДНК в мужской пронуклеус.

6) Развитие эмбрионов in vitro.

7) Имплантация одного эмбриона реципиентной самке во время течки.

8) Скрининг ДНК потомков на наличие трансгена.

Описанный выше метод, как показала практика, результативен, однако эффективность его весьма низка. Так, из 2470 оплодотворенных трансгенных яйцеклеток удалось получить двух трансгенных телят. Работа по усовершенствованию техники трансгеноза ведётся.

Одна из целей трансгеноза крупного рогатого скота — изменение содержания в молоке различных компонентов. Так, количество сыра, получаемого из молока, прямо пропорционально содержанию в нём κ-казеина. Увеличение количества этого белка в молоке возможно при помощи гиперэкспрессии трансгена этого белка. Ещё один пример: если обеспечить экспрессию гена лактазы в клетках молочной железы, то можно получить молоко, не содержащее лактозы. Такое молоко незаменимо для людей, не переносящих лактозу — после употребления молока или молочных продуктов у них возникает серьёзное желудочное расстройство.

Весьма перспективно создание домашних животных с наследственной устойчивостью к бактериальным и вирусным инфекциям и паразитарным инвазиям. Наиболее обнадёживающими в настоящее время являются предварительные результаты, полученные при введении мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих моноклональные антитела[3]. Идея этого подхода заключантся в том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации при помощи прививок.

 

Практическое занятие №11

Тема: Генотерапия

Лечение заболеваний с помощью генов получило название генотерапии. Сейчас в мире насчитывается порядка 400 проектов, посвященных лечению с помощью генотеропии. Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола.

Апробацию процедуры генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных культурах клеток больного, в которых в норме функционально активен данный ген. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают способы коррекции на биохимическом уровне. Используя культуры клеток, можно разработать систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако проверка надежности работы этой системы может быть осуществлена только на уровне целого организма. Поэтому такое внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных моделях соответствующих наследственных болезней у животных.

Успешная коррекция генетических дефектов у таких животных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной терапии являются важнейшей предпосылкой для разрешения клинических испытаний. Таким образом, стандартная схема генокоррекции наследственного дефекта включает серию последовательных этапов. Она начинается созданием полноценно работающей (экспрессирующейся) генетической конструкции, содержащей смысловую (кодирующую белок) и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обеспечивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени. Затем проводится трансфекция (перенос полученной конструкции) в клетки-мишени, оценивается эффективность трансфекции, степень коррегируемости первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro) и, что особенно важно, in vivo на животных - биологических моделях. Только после этого можно приступать к программе клинических испытаний.

Существует два типа генотерапии: заместительная и корректирующая.

Заместительная генотерапия заключается во вводе в клетку неповрежденного гена. Внесенная копия заменит по функциям сохранившийся в геноме больного дефектный ген. Все проводимые сегодня клинические испытания используют внесение в клетку дополнительных количеств ДНК.

При корректирующей терапии предполагается замена дефектного гена нормальным в результате рекомбинации. Пока этот метод на стадии лабораторных испытаний, так как эффективность его еще очень низка.

В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реинфузию их тому же пациенту.

Примером может служить лечение комбинированного иммунодефииицита. Комбинированный иммунодефицит может быть результатом дефекта гена аденозиндезаминазы. Впервые попытка лечения такого больного методами генотерапии была предпринята в США в 1990 г. У больного ребенка извлекли Т-лимфоциты, трансформировали ретровирусным вектором, введя нормальный ген аденозиндезаминазы и вернули клетки в организм. Введение приходится повторять. Более эффективна аналогичная трансформация стволовых клеток костного мозга.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. В настоящее время не существует общедоступного метода культивирования клеток легких, поэтому при легочных заболеваниях единственный способ доставить чужеродный ген - это ввести его прямо в организм. Муковисцидоз - весьма распространенное среди людей белой расы тяжелое наследственное заболевание легких, которое поражает, например, в семьях из Центральной Европы одного новорожденного из 2500 и для которого установлен дефектный ген, кодирующий белок-регулятор трансмембранной проводимости. Основное проявление дефектного гена – пневмония. Поражаются все эпителиальные клетки. Основная проблема – как доставить ген в клетки, покрытые слизью, которая препятствует трансформации. Неповрежденную копию "гена заболевания", включенную в аденовирусный вектор или липосому, вводят в форме аэрозоля в дыхательные пути больного.

Для коррекции нарушения при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна (заболевании мальчиков, связанном с дефектами Х-хромосомы) нормальный ген, кодирующий белок дистрофии, пытались прямо вкалывать в мышечные волокна, используя либо "голую" ДНК, либо аденовирусный вектор. Другие исследователи трансплантировали больному миобласты после генетической коррекции. Ранее неподвижный ребенок приобретал способность двигаться! К сожалению, во всех этих опытах удается получить только временный терапевтический эффект, и процедура введения гена должна неоднократно повторяться.

Список наследственных заболеваний, которые пытаются или планируют лечить генами, велик. Это и ревматоидный артрит, и фенилкетонурия, и заболевания, связанные с недостатком гормонов (инсулина, эритропоэтина, гормона роста). В случае хронической анемии, связанной с дефицитом эритропоэтина, на основании опытов на животных предлагается принципиально новый подход к лечению. Так как каждая из наших клеток содержит один и тот же геном, можно заставить фибробласты кожи, которые в норме не производят эритропоэтина, синтезировать этот гормон. Для этого нужно ввести в геном новую контролирующую область и тем самым снять запрет со считывания (экспрессии) гена эритропоэтина, присутствующего, но "молчащего" в фибробластах.

Практически в любой области медицины либо начаты клинические испытания лечения наследственных заболеваний с помощью генотерапии, либо в опытах на животных разрабатываются подходы к такому лечению. По мере усовершенствования методов доставки генов и контроля их экспрессии список заболеваний, к которым можно применять генотерапию, будет безусловно расширяться.

Генотерапия применима не только к наследственным заболеваниям. Предстоит решить проблему лечения генами "чумы XX века" — синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), возникающего при заражении вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ представляет собой ретровирус, поражающий Т-лимфоциты и макрофаги. Болезнь удалось бы победить, если бы были найдены новые гены, введение которых в зараженные ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее размножение вируса. Предложено множество хитроумных способов борьбы со СПИДом с помощью привнесенных генов. Все они основаны на новейших данных о строении и функционировании генома ретровируса. Например, вводя прямо в мышцы больного ретровирусные векторы, несущие отдельные гены ВИЧ, ученые рассчитывали на то, что гены ВИЧ после внедрения в ДНК хромосом хозяина смогут дать информацию для синтеза вирусных белков и произойдет "противоСПИДная" иммунизация больного этими белками. Однако еще не получено ощутимых результатов, которые сулили бы успех в борьбе с вирусом дикого типа, коварство которого заключается в его изменчивости.

Огромные перспективы открывает использование генотерапии для лечения онкологических заболеваний. Многолетние усилия ученых привели к пониманию того, что рак — это генетическое заболевание и его развитие происходит многостадийно, в результате серии генетических нарушений, накапливающихся в клетке. Следовательно, каждый из таких отдельных генетических эффектов может стать точкой приложения генотерапевтического подхода.

КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ

 

Амплификация ДНК (лат. amplificatio — усиление, увеличение) — увеличение числа копий молекул ДНК, либо увеличение числа копий гена в геноме организма. В генной инженерии часто применяется амплификация молекул ДНК методом ПЦР (см.).

Антиген — вещество (обычно белки, реже полисахариды), вызывающее у животных иммунный ответ (образование антител).

Антитело — белок (иммуноглобулин), образуемый иммунной системой организма животных в ответ на введение антигена и способный вступать с ним в специфическое взаимодействие.

Бактериофаг (часто произносится и пишется сокращенно — фаг) — вирус, паразитирующий на бактериях. Состоит из ДНК или РНК, упакованной в белковую оболочку — капсид.

Блоттинг — перенос молекул ДНК, РНК или белка из геля, в котором шёл электрофорез, на фильтр (мембрану).

Вакцина — препарат ослабленного или убитого инфекционного агента (вируса, бактерии и т. п.) или его отдельных компонентов, несущих антигенные детерминанты, способный вызывать образование иммунитета к данной инфекции у животных (человека). Кроме того, в последнее время появились вакцины, произведенные методами генной инженерии (примером такой вакцины может служить вакцина против гепатита B).

Вектор (в генетике) — молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала другой клетке. Вектор представляет собой либо искусственно модифицированную плазмиду (см.), выделенную из клеток бактерии, либо искусственно модифицированный геном бактериофага (см.) или другого вируса, либо конструкцию, объединяющую в себе фрагмент плазмиды и фагового генома. В связи с этим принято различать плазмидные, фаговые и плазмидно-фаговые векторы. Зачастую вертор содержит также один или более генетических маркёров (см.), необходимых для успешного скрининга (см.).

Ген — структурная и функциональная единица наследственности, контролирующая развитие определенного признака или свойства. Материально ген представляет собой участок молекулы ДНК, несущий целостную информацию о строении одной молекулы белка или одной молекулы РНК. В составе гена, помимо кодирующей области, имеются регуляторные участки, отвечающие за частоту экспрессии данного гена (см. также: промотор, экспрессия гена).

Генетическая карта — схема расположения структурных генов и регуляторных элементов в хромосоме.

Генетически модифицированные источники (ГМИ) — таковыми считаются все, присутствующие в продуктах, генетически модифицированные организмы (бактерии, грибы, животные и растения). ГМИ могут присутствовать в продуктах питания, либо являться биореакторами при производстве лекарственных средств (гормонов человека, антибиотиков, вакцин и пр.) и витаминов.

Генетически модифицированные продукты (ГМП) — продукты питания, в состав которых входят ГМИ.

Генетически модифицированный организм (ГМО) — живой организм, генотип которого был искусственно изменён при помощи методов генной инженерии. Синоним: трансгенный организм.

Гено́м — совокупность всех генов организма; его полный хромосомный набор.

Гетеродуплекс (см.: дуплекс).

Гибридная ДНК (см.: рекомбинантная ДНК).

ГМО (см. генетически модифицированный организм).

ГМИ (см. генетически модифицированные источники).

ГМП (см. генетически модифицированные продукты).

Денатурация — нарушение пространственной структуры молекулы в результате разрыва внутри- или межмолекулярных нековалентных связей. Под денатурацией ДНК или РНК понимается разрушение водородных связей в дуплексах и расхождение составляющих их нитей.

ДНК-полимеразы — класс ферментов, играющих ключевую роль в репликации ДНК. Катализируют реакцию присоединения следующего нуклеотида к 3’ концу синтезируемой нуклеотидной цепочки. Подбор нужного нуклеотида осуществляется путём использования комплементарной нити в качестве матрицы. Различают ДНК-зависимые ДНК-полимеразы (синонимы: обратные транскриптазы, ревертазы), использующие в качестве матрицы комплементарную цепь ДНК, и РНК-зависимые ДНК-полимеразы, катализирующие синтез нити ДНК на РНК-матрице (см. обратная транскрипция).

Дуплекс— двунитевая молекула нуклеиновой кислоты, закрученная в форме спирали. Нити в дуплексах соединяются водородными связями по принципу комплементарности азотистых оснований. Как правило, ДНК в клетках присутствует в виде дуплекса — двойной спирали (однонитевыми ДНК представлены геномы некоторых вирусов), частично переходя в однонитевую форму во время актов транскрипции и репликации. РНК также способна образовывать дуплексы. Кроме того, существуют гетеродуплексы, одна из нитей которых представлена молекулой ДНК, а другая — молекулой РНК.

Интерфероны — белки, синтезируемые клетками позвоночных в ответ на вирусную инфекцию, подавляющие развитие вирусов.

Капсид— оболочка вируса, состоящая из белков-капсомеров.

Компетентность (генетическая) — способность клеток поглощать чужеродную ДНК из внешней среды (см.: трансформация).

Комплементарность (в генетике) — свойство азотистых оснований образовывать с помощью водородных связей парные комплексы аденин—тимин (или урацил) и гуанин—цитозин при взаимодействии цепей нуклеиновых кислот.

Космида— вектор, содержащий cos-сайт ДНК фага λ.

Линкер — короткий синтетический олигонуклеотид, применяемый для соединения фрагментов ДНК in vitro; обычно содержит участок узнавания определённой рестриктазой. Если линкер содержит несколько сайтов узнавания различными рестриктазами, он называется полилинкер.

Липкие концы — комплементарные однонитевые участки ДНК, расположенные на концах дуплексов ДНК.

Локус — участок ДНК (хромосомы), где расположена определённая генетическая детерминанта. Близкий по значению термин: сайт.

Маркёр (синоним: маркерный ген) — ген в рекомбинантной ДНК, кодирующий хорошо различимый селективный признак.

Молекулярное клонирование — технология многократного копирования фрагментов ДНК, осуществляемая путем встраивания целевого фрагмента в геном живого организма (например, бактерии), вируса или в живые клетки культуры тканей и последующего размножения трансформантов.

Нокаут гена — целенаправленное внесение определенных мутаций (вплоть до полного удаления фрагмента ДНК из генома), приводящих к избирательной инактивации гена.

Нуклеазы — общее название ферментов, расщепляющих молекулы нуклеиновых кислот.

Обратная транскрипция — это процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК. Осуществляется при участии ферментов обратных транскриптаз (см. ДНК-полимеразы). В генной инженерии этот процесс используется для создания новых генов на основе имеющихся матричных РНК.

Отжиг(см.: ренатурация).

Плазмиды — дополнительные факторы наследственности, расположенные в клетках вне хромосом и представляющие собой кольцевые (замкнутые) или линейные молекулы ДНК. Обнаружены у большинства прокариот и некоторых низших грибов. Каждая плазмида имеет точку начала репликации (ori), что дает ей возможность автономно реплицироваться в клетке и наследоваться дочерними клетками. Это свойство позволяет использовать их в генной инженерии в качестве вектора.

Полилинкер (см.: линкер).

Полимера́зная цепная реакция (ПЦР) — метод амплификации молекул ДНК, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Метод ПЦР широко используется не только в генной инженерии, но и в судебно-медицинской экспертизе, генетической генеалогии, молекулярной филогенетике и других областях науки и технологии.

Праймер (англ. primer) — это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, который служит стартовой точкой при репликации ДНК. Праймеры необходимы ДНК-полимеразам, так как ферменты этого класса могут только наращивать существующую цепь, но не начинать ее синтез «с нуля».

Пролиферация – размножение клеток.

Промотор — участок гена, узнаваемый РНК-полимеразой как стартовая площадка для начала транскрипции. От структуры промотора в значительной степени зависит уровень экспрессии генов (см.). Различают сильные промоторы – обеспечивающие высокий уровень экспрессии генов в клетке-хозяине и слабые промоторы, обеспечивающие более низкий уровень экспрессии. «Сила» промотора зависит от того, в клетках какой ткани или какого организма он находится, а также от положения гена в хромосоме.

ПЦР — (см. полимера́зная цепная реакция).

Рекомбинантная ДНК (синоним: гибридная ДНК) — молекула ДНК, созданная путём искусственного соединения фрагментов ДНК различного происхождения.

Ренатурация — восстановление исходной пространственной структуры молекул. В отношении нуклеиновых кислот ренатурация означает восстановление двунитевой структуры за счет образования водородных связей между комплементарными основаниями (у этого процесса есть и другое название — отжиг), которые были разрушены при денатурации (см.).

Рестриктазы (синоним: эндонуклеазы рестрикции) — ферменты из класса гидролаз, катализирующие реакцию гидролиза (разрезания) молекул нуклеиновых кислот в определенных участках. Каждая рестриктаза узнаёт специфический участок ДНК длиной 4–6 пар нуклеотидов (сайт рестрикции). В генной инженерии являются одним из основных инструментов при создании рекомбинантных ДНК (см.). Чаще всего используются т.н. рестриктазы второго класса, гидролизующие ДНК внутри сайта рестрикции или на небольшом, фиксированном расстоянии от него.

Рестрикты — фрагменты ДНК, образовавшиеся после её гидролиза рестриктазой (см.).

Рестрикция — разрезание на фрагменты молекулы ДНК или РНК с помощью ферментов-рестриктаз (см.).

Сайт(генетический) — участок молекулы ДНК, РНК или белка, в котором локализована определенная генетическая детерминанта, мутация, участок узнавания определенной рестриктазой (сайт рестрикции) и т.п.

Секвенирование — установление последовательности нуклеотидов в молекулах нуклеиновых кислот или последовательности аминокислотных остатков в белках (полипептидах).

Скрининг — выявление и отбор организмов, несущих в геноме рекомбинантную ДНК.

Трансген — чужеродный фрагмент ДНК, переносимый при помощи генно-инженерных манипуляций в геном определенного организма. Трансген может быть выделен из биологического объекта или синтезирован искусственно. Организм, получившийся в ходе переноса и встраивания в геном трансгена, называют трансгенным.

Трансгеноз (синоним: трансгенез) — процесс переноса и встраивания генетического материала из организма одного вида, в организм другого вида.

Трансге́нный организм (синоним: генетически модифицированный организм) — живой организм, в геном которого искусственно введен ген другого организма.

Трансфе́кция - процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки человека и животных невирусным методом. Аналогичный процесс в отношении бактерий, дрожжей и растений называется трансформация.

Трансформация (см. трансфекция).

Фаг (см. бактериофаг).

Химера (в генетике) — организм или часть организма, состоящие из генетически разнородных тканей или клеток.

Целевой фрагмент ДНК — участок ДНК, несущий гены, которые необходимо перенести в геном вновь создаваемого трансгенного организма (см. трансген). Эти гены кодируют фенетические признаки, ради которых создается трансгенный организм (например: способность синтезировать инсулин человека трансгенными бактериями, устойчивость к колорадскому жуку у трансгенного картофеля и пр.).

Экспрессия гена — это процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Экспрессия генов может регулироваться на всех стадиях процесса: и во время транскрипции, и во время трансляции, и на стадии посттрансляционных модификаций белков. При введении в геном организма чужеродных генов кране важно предугадать уровень (частоту) их экспрессии на новом месте. Недостаточно высокий уровень экспрессии целевых генов может служить причиной неудачи эксперимента по созданию трансгенного организма.

Эндонуклеазы рестрикции (см.: рестриктазы).

 

 

Вопросы для самостоятельного изучения

1. История развития генетической инженерии.

2. Схема типового эксперимента в генной инженерии.

3. Источники ДНК для клонирования.

4. Плазмидные, фаговые и плазмидно-фаговые векторы

5. Векторы, сконструированные на основе фага М13

6. Векторы на основе фага λ

7. Челночные векторы

8. Сегмент-направленный мутагенез in vitro.

9. Олигонуклеотид-направленный мутагенез in vitro.

10. Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах.

11. Экспрессия генов при участии сильных регулируемых промоторов.

12. Использование для экспрессии различных микроорганизмов.

13. Использование бактерий рода Agrobacterium для создания генетически модифицированных растений.

14. Строение и функции плазмид Ti и Ri.

15. Структура Т-области плазмид Ti.

16. Синтез в организмах чужеродных белков медицинского назначения.

17. Синтез съедобных вакцин трансгенными растениями.

18. Трансгенные растения с новыми биотехнологическими свойствами.

19. Трансгенные животные в фундаментальных исследованиях.

20. Биотехнологическое применение трансгенных животных.