Реакция непрямой агглютинации (гемагглютинации) (РНГА)

При пассивной агглютинации растворимые антигены (белки, полисахариды и их комплексы микробного происхождения) соединяют с нерастворимым носителем, выполняющим исключительно индикаторную функцию. Носителем могут быть эритроциты, частицы латекса, поликриламида, бентонита и др. Связывание антигена с носителем происходит в результате адсорбции или химического соединения. Микробные полисахариды, например, можно адсорбировать на нативных эритроцитах без какой-либо их предварительной обработки. Различные белки (в том числе микробные ферменты) возможно присоединять к эритроцитам, только обработав их различными химическими веществами, обладающими дубильным действием: танином, хромахлоридом, формальдегидом или бисдиазотированным бензидином. Такая обработка предотвращает разрушение красных кровяных клеток, которое может произойти при непосредственном контакте антигена с эритроцитами. Когда антиген, связанный с носителем, соответствует антителу, наблюдается агглютинация частиц носителя. Чувствительность непрямой реакции агглютинации 0,02… 0,04 мкг азота белка антител/мл.

Методика. Кровь, взятую из яремной вены взрослого барана, помещают в стеклянную банку с бусами, дефибринируют встряхиванием в течение 10-15 мин и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. После центрифугирования в течение 10 мин при 2000 об/мин эритроциты отмывают 3-4 раза в изотоническом растворе натрия хлорида, осадок ресуспендируют в нем и добавляют 5-кратный объём 4% формалина (рН 7,0), в котором оставляют эритроциты на 3-4 дня при температуре 4ºС. Затем эритроциты вновь осаждают и повторяют процедуру со свежим раствором формалина, после чего их отмывают 20-кратным объёмом изотонического раствора натрия хлорида и доводят до 20% концентрации. Фиксированные эритроциты хранят при температуре 4ºС.

Пригодность эритроцитов контролируют следующим образом: 1) после замораживания и оттаивания 5% взвеси эритроцитов в дистиллированной воде гемолиза не наблюдается; 2) при смешивании 0,1 мл 0,2% взвеси эритроцитов с изотоническим раствором натрия хлорида спонтанной агглютинации не наблюдается.

Для сенсибилизации эритроцитов к 8 объёмам дистиллированной воды добавляют 1 объём антигена, 1 объём 50% взвеси формалинизированных эритроцитов и 1 объём 0,1-0,2% раствора хрома хлорида или танина в разведении 1:20000-1:2000000.

Смесь оставляют на 10-15 мин при комнатной температуре, затем добавляют равный объём изотонического раствора натрия хлорида и центрифугируют 20 мин при 2000об/мин. Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывают 2-3 раза 20-кратным объёмом изотонического раствора натрия хлорида, затем ресуспендируют до 5% концентрации в стабилизирующем растворе, состоящем из равным объёмов 30% раствора сахарозы и донорской сыворотки человека.

В качестве контроля используют формалинизированные эритроциты, сенсибилизированные другим антигеном, или формалинизированные несенсибилизированные эритроциты.

РНГА удобно ставить на микропанелях аппарата Такачи, используя для разведения материала микротитратор. Исследуемые сыворотки прогревают 30 мин при температуре 56ºС для удаления неспецифических гемагглютининов, готовят 2-кратные разведения на стабилизирующем растворе и по 1 капле каждого разведения вносят в две лунки U-образного микротитратора Такачи. В первый ряд добавляют по одной капле 1% суспензии сенсибилизированных антигеном эритроцитов, во второй ряд – такое же количество контрольных эритроцитов. Пластины тщательно встряхивают и помещают на 30-40мин в термостат при температуре 37ºС.

Результаты реакции учитывают по наличию гемагглютинации. Положительна она в том случае, если титр гемагглютинации с опытными эритроцитами по меньшей мере в 4 раза превышает титр гемагглютинации с контрольными эритроцитами. Обязателен контроль сенсибилизированных эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации.