Спектрофотометрический анализ биологических объектов

Для исследования физико-химических свойств биологических объектов широко используют различные спектральные методы, в том числе и абсорбционную спектрофотометрию. Регистрируемые при этом спектральные параметры поглощения (положение полос поглощения, их полуширина, соотношение амплитуд максимумов и т.д.) дают информацию о качественном и количественном соотношении компонентов биологической системы, их состоянии и структурной организации.

Однако в некоторых случаях исследуемый объект состоит из частиц, образующих скорее суспензию, чем раствор (например, суспензии клеток, клеточных органелл и т.д.). Это приводит к тому, что кроме поглощения света в изучаемом образце может наблюдаться его рассеяние. Под светорассеянием в данном случае понимается отклонение квантов измерительного пучка света, проходящего через образец, от их первоначального направления распространения. В результате этого на фотоэлемент, расположенный за объектом, попадает меньше света, что в свою очередь приводит к завышению измеряемой оптической плотности. Кроме того, если исследуемая суспензия довольно "густая", то светорассеяние может быть многократным, т.е. после рассеяния кванта света на одной частице может произойти его рассеяние на второй, третьей частице и т.д. Это приводит к увеличению фактической длины оптического пути луча света, проходящего через образец, в результате чего оптическая плотность рассеивающего объекта также повышается.

В общем случае светорассеяние сказывается на форме спектров поглощения следующим образом: 1) потеря части светового потока приводит к общему подъему спектральной кривой; 2) подъем кривой часто более значителен в коротковолновой области вследствие увеличения светорассеяния с уменьшением длины волны; 3) увеличение оптической плотности более выражено в минимумах поглощения, поэтому сглаживаются различия между минимумами и максимумами.

Вещества, поглощающие свет в биологических системах, обычно не распределены равномерно по всему объёму, а сосредоточены в клеточных структурах: хлоропластах, митохондриях и т. д. Часть лучей, пронизывая поглощающие частицы, сильно ослабляется, тогда как другая часть лучей "проскакивает" через толщу образца без поглощения. Это так называемый эффект "сита" (или "проскока"). Эффект «сита» приводит к тому, что в интенсивных максимумах поглощения оптическая плотность становится меньше, чем оптическая плотность хромофора той же концентрации.