Лекция № 7. Медицинская биотехнология и генная инженерия. Микробиологические основы антимикробной профилактики и терапии.
Биотехнология - использование в производстве живых организмов и биологических процессов.
Достижения научно - технического прогресса способствовали развитию новых биологических технологий создания диагностических, лечебных и профилактических препаратов, решению проблем сбалансированности питания, экологических проблем. Основные принципы биотехнологии - ферментация, культивирование микроорганизмов, растительных и животных клеток, генная и клеточная инженерия. Генная инженерия - сердцевина современной биотехнологии.
Объем российского рынка биотехнологии оценивается более чем в $1 млрд. Самый крупный потребитель - фармацевтика, далее - пищевая промышленность (закваски для производства кисломолочных продуктов, дрожжи и ферменты для производства спирта и мясопереработки), сельское хозяйство (лизин, витамины, культуры полезных бактерий). В мире основными секторами биотехнологического рынка являются продукты для пищевой промышленности и сельского хозяйства, фармацевтическая продукция, ферменты и препараты для производства моющих средств, посадочный материал модифицированных растений, натуральные косметические средства.
На основе достижений генетики разработаны высокоточные методы диагностики и идентификации микроорганизмов - определение плазмидного профиля, рестрикционный анализ, ДНК - гибридизация, полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование. Методы основаны на использовании ряда специфических ферментов - рестриктаз (ферментов, расщепляющих ДНК в специфических участках), лигаз или синтетаз (обеспечивают соединение двух молекул), в частности ДНК - лигаз (получение рекомбинантных молекул ДНК), полимераз (ДНК - зависимая ДНК - полимераза обеспечивает полимеразную цепную реакцию – ПЦР - многократное реплицирование специфического участка нуклеотидной последовательности).
Плазмиды (F- плазмиды) и вирусы (бактериофаги) используют в генной инженерии в качестве векторов для переноса генетического материала (генов). Метод клонирования заключается в том, что выделенный фрагмент (ген) вводится в состав плазмиды или другой самореплицирующейся системы и накапливается в размножающихся клетках. Практический вариант использования: микроорганизмы - продуценты биологически активных веществ (в том числе вакцин). Гибридомную технологию используют для получения моноклональных антител (МКА).
Кроме клонирования для получения генов используют химический синтез. С помощью генно-инженерных методов получают вакцины, антигены, диагностикумы, гормоны, иммуномодуляторы. Одним из крупных разделов биотехнологии является производство антибиотиков и различных химиотерапевтических препаратов антибактериального действия.
Методы воздействия на микроорганизмы по виду использованного фактора можно разделить на физические и химические, по характеру воздействия - на неизбирательные (обеззараживание - дезинфекция, стерилизация) и избирательные (химиотерапевтические).
Физические методы.
1.Термическая обработка - прокаливание, кипячение, пастеризация, автоклавирование.
2.Облучение - ультрафиолетовое, гамма - и рентгеновское, микроволновое.
3.Фильтрование (оптимально - бактериологические фильтры с диаметром пор около 200 нм).
Химические методы.
1.Неспецифического действия - дезинфектанты (обработка помещений и др., антисектики - обработка живых тканей). Среди них - препараты йода и хлора, спирты, альдегиды, кислоты и щелочи, соли тяжелых металлов, катионные детергенты, фенолы, окислители, природные препараты - деготь, ихтиол, хлорофиллипт.
2.Избирательно подавляющие жизнедеятельность микроорганизмов - антибиотики и химиотерапевтические препараты.
Эре антибиотикотерапии предшествовал период разработки антимикробных химиопрепаратов. Некоторые вехи: в 1891г. Д.А.Романовский сформулировал основные принципы химиотерапии инфекционных болезней, предложил хинин для лечения малярии, П.Эрлих в 1906г. предложил принцип химической вариации. Синтезированы производные мышьяка сальварсан и неосальварсан, предложен химиотерапевтический индекс. Круг химиопрепаратов постепенно расширялся. В 1932г. открыты подходы к созданию сульфаниламидных препаратов. Однако революционное значение имело открытие антибиотиков.
Одним из универсальных механизмов антагонизма микроорганизмов является синтез антибиотиков, которые тормозят рост и размножение микроорганизмов (бактериостатическое действие) или убивают их (бактерицидное действие). Наиболее широкое определение: антибиотики - вещества, которые могут быть получены из микроорганизмов, растений, животных тканей и синтетическим путем, обладающие выраженной биологической активностью (бактерицидным или бактериостатическим действием) в отношении микроорганизмов.
Таких веществ известно несколько тысяч, однако используют значительно меньше. Существует ряд требований к антибиотикам, существенно ограничивающих их терапевтическое применение:
- эффективность в низких концентрациях, выраженный бактериостатический и (или) бактерицидный эффект;
- стабильность в организме и в различных условиях хранения;
- низкая токсичность или ее отсутствие;
- отсутствие выраженных побочных эффектов, прежде всего - иммунодепрессивного действия.
Первыми открытыми антибиотиками были пенициллин (Флеминг) и стрептомицин (Ваксман).
Антибиотики могут быть разделены по происхождению, направленности и спектру действия, по механизму действия.
По происхождению антибиотики могут быть:
- бактериального происхождения (полимиксин, грамицидин);
- актиномицетного происхождения (стрептомицин, левомицетин, эритромицин);
- грибкового происхождения (пенициллин);
- растительного происхождения (рафанин, фитонциды);
- животного происхождения (интерфероны, лизоцим).
Больше всего известно антибиотиков актиномицетного происхождения. Актиномицеты - преимущественно почвенные микроорганизмы. В условиях большого количества и разнообразия почвенных микроорганизмов их антагонизм, в том числе с помощью выработки антибиотиков - один из механизмов их выживания.
По спектру действия антибиотики разделяют на действующих на:
- преимущественно на грамположительную микрофлору - пенициллин, эритромицин;
- преимущественно на грамотрицательную микрофлору - полимиксин;
- на грам-плюс и грам-минус флору (широкого спектра действия) - стрептомицин, неомицин;
- на грибы (антимикотики) - нистатин, амфотеррицин, леварин, низорал;
- на микобактерии (противотуберкулезные) - стрептомицин, канамицин;
- противоопухолевые - рифампицин;
- противовирусные - интерферон, зовиракс, ацикловир.
Антибиотики разделяют по механизму действия:
- ингибиторы синтеза пептикогликана клеточной стенки (пенициллин, цефалоспорин, ванкомицин, ристомицин). Действуют на имеющих клеточную стенку растущие бактерии, не действуют на L- формы, покоящиеся формы бактерий;
- ингибиторы синтеза белка (стрептомицин, левомицетин, тетрациклин);
- ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, пуринов и аминокислот (налидиксовая кислота, рифампицин);
- ингибиторы синтеза мембраны и цитоплазматической мембраны грибов (нистатин, полимиксин).
Побочное действие антибиотиков.
Для макроорганизма:
- токсическое действие;
- дисбактериозы;
- аллергические реакции;
- иммунодепрессивное действие;
- эндотоксический шок.
Для микроорганизмов:
- формирование атипичных форм микробов;
- формирование антибиотикорезистентных и антибиотикозависимых форм микроорганизмов.
Биохимические и генетические механизмы лекарственной устойчивости микроорганизмов.
Существует два типа лекарственной устойчивости - природная и приобретенная (в результате мутаций, обмена R - плазмидами др.).
Естественная лекарственная устойчивость является видовым (хромосомным, генетически детерминированным) признаком, чаще связана с недоступностью антибиотика к его мишени, т.е. невозможностью осуществления его механизма действия. В природных условиях, особенно в почве, микроорганизмы находятся в конкурентной борьбе за субстраты. Антибиотики - один из селективных факторов отбора. Микроорганизмы - продуценты антибиотиков защищены от синтезируемых антибиотиков генетическими механизмами (генетически детерминированная устойчивость, кодируемая в хромосоме или обусловленная наличием R - плазмид). Микроорганизмы в условиях совместного обитания вынуждены вырабатывать устойчивость к антибиотикам.
Резистентность к антибиотикам у микробов может быть связана с негенетическими факторами (низкая метаболическая активность, переход в L- форму).
Основную роль в лекарственной устойчивости принадлежит R - плазмидам, способным передаваться в другие бактерии и формировать своеобразный генофонд лекарственной устойчивости микроорганизмов. Резистентность современных стафилококков к пенициллину доходит до 100%.
На биохимическом уровне в формировании резистентности могут участвовать различные механизмы.
1.Разрушение молекулы антибиотика (пенициллины и другие бета - лактамные антибиотики разрушаются ферментом бета - лактамазой).
2.Модификация структуры молекулы антибиотика, приводящая к утрате биологической активности (так действуют изоферменты).
3.Изменение структуры мишеней, чувствительных к антибиотику (белков 70S рибосом - устойчивость к тетрациклинам, стрептомицину, макролидам, гираз - к хинолонам, РНК - полимераз - к рифампицину, пенициллинсвязывающих белков - транспептидаз - к бета - лактамам).
4.Образование бактериями “обходного” пути метаболизма.
5.Формирование механизмов активного выведения антибиотика из клетки.
Из-за формирования антибиотикоустойчивых популяций микроорганизмов с целью эффективного лечения необходимо предварительно определять чувствительность данного антибиотика к выделенной культуре возбудителя.
Основными методами определения антибиотикочувствительности бактерий in vitro является метод серийных разведений, диффузии в агар (бумажных дисков), определение способности к продукции бета - лактамазы, in vivo - на модели безмикробных животных, определение концентрации антибиотиков в крови и моче.
Метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, пропитанных различными антибиотиками в определенных концентрациях (зависят от терапевтической дозы и соответствуют рекомендациям ВОЗ). Метод основан на использовании стандартных питательных сред, дисков и методов. Оценка результатов связана с существованием зависимости между размером зоны подавления роста исследуемых культур вокруг дисков и значениями минимальных подавляющих концентраций (МПК) соответствующих антибиотиков (чувствительностью микроорганизмов). Имеются специальные таблицы для оценки результатов, в соответствии с которыми культуры определяют как чувствительные, умеренно устойчивые и устойчивые (резистентные) к тестируемому антибиотику.
Метод серийных разведений антибиотиков позволяет более точно определить МПК, однако из-за громоздкости применяется реже.
Бета - лактамазный тест (определение способности к образованию бета - лактамаз) чаще определяют методом дисков с нитроцефином - цефалоспорином, изменяющим окраску дисков при гидролизе. Положительный тест свидетельствует о резистентности бактерий ко всем антибиотикам, имеющим в структуре бета - лактамазное кольцо.
Существует ряд причин, обусловливающих различную чувствительность микроорганизмов к антибиотикам in vitro и in vivo.
На антимикробную активность in vitro влияют многие факторы, в том числе:
- рН среды;
- компоненты среды;
- концентрация микроорганизмов;
- условия и время культивирования.
На антимикробную активность препаратов in vivo также влияют различные факторы, из которых необходимо отметить:
- фармакодинамику препарата в организме (скорость всасывания, выведения, расщепления и т.д.);
- локализацию микробов в организме (особенно внутриклеточную локализацию).