Глубинное культивирование плесневелых грибов и других микроорганизмов

При глубинном культивировании микроорганизмы развиваются во всем объеме жидкой питательной среды. Так как подавляющее большинство продуцентов ферментов — строгие аэробы, среду интенсивно аэрируют. В микроорганизмах протекают два неразрывно связанных процесса — синтез биомассы и синтез ферментов.

Для максимального накопления ферментов необходимы определенный состав питательной среды, обеспечение кислородом возду­ха, своевременный отвод метаболитов и физиологического тепла, оптимальные значения рН и температуры. Важнейшим условием является также стерильность питательной среды, подаваемого воз­духа, ферментаторов, трубопроводов и арматуры.

Известны следующие способы глубинного культивирования: периодический, непрерывноциклический и непрерывно-проточный.

Периодический способ характеризуется несменяемостью питательной среды в ферментаторе, состав которой в процессе развития постепенно изменяется. Процесс протекает постадийно: в фермен­татор набирают питательную среду и задают посевной материал; после размножения микроорганизмов и накопления продуктов их обмена зрелую культуру выгружают, а все оборудование, коммуникации- и запорные устройства промывают и стерилизуют паром.

По непрерывноциклическому способу микроорганизмы, расположенные на неподвижной насадке в ферментаторе, непрерывно омываются средой, протекающей в замкнутом контуре, до полного потребления имипитательных веществ. После этого зрелую куль­туру выгружают, аппарат промывают, стерилизуют и цикл повто­ряют. Богатая среда в ходе такой циклической ферментации по­степенно истощается; по времени этот процесс более продолжителен, чем непрерывно-проточный.

Способ непрерывно-проточного культивирования микроорганиз­мов более совершенен. Суть его заключается в том, что микробная популяция развивается в проточной питательной среде. Непрерыв­ный способ имеет две разновидности: гомогенно-непрерывный и градиентно-непрерывный. В первом случае выращивание ведут в одном ферментаторе; при тщательном перемешивании среды и аэра­ции обеспечивается одинаковое состояние культуры во всем объеме жидкости. В ферментатор при этом непрерывно поступает свежая среда, а из него также непрерывно вытекает избыток культуральной жидкости.

 

 

Градиентно-непрерывное культивирование осуществляют в батарее ферментаторов, соединенных переточными трубами. Засеянная среда с большим содержанием углеводов и других ингредиен­тов непрерывно перетекает из одного ферментатора в другой и так­же непрерывно вытекает в виде готовой культуры.

Непрерывное культивирование в проточных средах позволяет выращивать микроорганизмы в условиях, оптимальных для их возрастного состояния. При этом такие важные факторы, как концентрация питательных веществ, содержание продуктов обмена, рН, содержание растворенного кислорода, резко изменяющиеся при периодическом способе культивирования, поддерживаются постоянными на заданном уровне или изменяются по усмотрению опера­тора.

Способы непрерывного культивирования в производстве ферментных препаратов для спиртового производства не вышли еще из стадии испытаний. Поэтому в настоящее время на заводах применяют периодическое культивирование микроорганизмов.

На рис. 58 приведена технологическая схема установки по полу­чению глубинной культуры Asp. Batatae 61.

Барда из брагоректификационного аппарата поступает в непре­рывно действующий фильтр 1 для отделения крупных частиц дро­бины. Фильтр представляет собой полуцилиндрическое или коническое сито с отверстиями диаметром 1,5—2 мм. С фильтра отбирают 15—20% жидкой части с 0,05% дробины (в исходной барде содержалось ее 1,3 — 2,7%) в сборники 2 и центробежным насосом 3 пе­рекачивают ее в смеситель 9, служащий для приготовления пита­тельной среды. Другие компоненты среды — муку, магнезит и мел — смешивают с водой в сборнике 4, из которого насосом 5 пе­рекачивают также в смеситель 9.

В смесителе питательную среду тщательно перемешивают и раствором гидроксида натрия доводят рН до 5,6—5,8. Затем среду стерилизуют, для чего насосом 10 ее подают в контактную головку 8, нагревают с 75—80°С до 128—130°С, выдерживают в трубчатом аппарате // в течение 40—50 мин и охлаждают до 30—32°С в по­верхностном теплообменнике 12.

Стерилизованная и охлажденная среда поступает в ферментаторы 13 — вертикальные цилиндрические сосуды с лучевыми аэраторами или с двухъярусными турбинными мешалками и барботером для подвода воздуха.

В тех случаях, когда теплообменник отключают для профилактического ос­мотра или ремонта, горячую среду из выдерживателя по обходной коммуникации передают непосредственно в ферментатор. В процессе заполнения ферментатора в нем поддерживают избыточное давление 0,25 МПа паром, подаваемым по воз­духоводу через аэрирующее устройство. Коэффициент заполнения ферментатора 0,75—0,85. При меньшем его значении объем доводят до нормы подачей барды из смесителя 9 через систему стерилизации. После заполнения ферментатора всю систему освобождают от среды, прокачивают водой и стерилизуют острым паром. Питательную среду в ферментаторе охлаждают до 30—32°С.

В ферментаторе среду засевают культурой гриба из маточника 14. До засева из ферментатора отбирают пробы через пробоотбор­ник для микробиологического контроля (высев на МПБ или МПА) и биохимических анализов. Засев осуществляют по линии передавливания, предварительно стерилизованной от маточника до фер­ментатора острым паром в течение 1 ч. Для этого закрывают вентиль на выходной воздушной линии у маточника и поднимают в нем дабление до 0,06—0,08 МПа, оставляя в ферментаторе давле­ние 0,02—0,03 МПа, после чего открывают вентиль на линии передавливания у маточника и ферментатора и в связи с разностью давления посевную культуру из маточника передавливают в ферментатор. Если маточник один на два ферментатора, то из него передавливают только 50% культуры. После этого закрывают венти­ли на линии передавливания, в ферментаторе приводят во враще­ние мешалку и начинают процесс выращивания культуры.

Маточник представляет собой цилиндрический сосуд со сфери­ческим днищем, оборудованный устройством для аэрации и переме­шивания, патрубками для подачи питательной среды, спуска промывных вод, подачи пара, подвода и отвода воздуха. После передавливания всей посевной культуры из маточника выпускают воздух, открывают крышку и внутреннюю поверхность тщательно моют. Затем маточник стерилизуют и заполняют питательной сре­дой для следующего цикла приготовления посевного материала.

Питательную среду для маточника готовят в смесителе 6, обору­дованном миксером. Вначале в смеситель набирают воду, включа­ют миксер и постепенно вносят муку, кукурузный экстракт и растительное масло. Размешивание среды производится не только миксером, но и в результате циркуляции ее насосом 7; рН среды доводят серной кислотой до 5,6—5,8.

Тем же насосом среду подают через контактную головку 8 в ма­точник, где ее выдерживают 1,5—2 ч при 126—132^СС, охлаждают до 30—32°С и засевают спорами гриба, выращенного в колбах на отрубях, через посевной лючок с соблюдением условий стерильно­сти и при минимальном движением воздуха в цехе. После засева открывают вентили для подачи и отвода воздуха. Расход воздуха 50—60 м3/(м3-ч), его температура 35—40°С. Продолжительность культивирования 36 ч. При задержке передачи посевной культуры в ферментаторы ее расхолаживают в маточнике подачей воды в рубашку и сохраняют при обязательной аэрации.

Подготовку воздуха, подаваемого в маточники и ферментаторы, проводят следующим образом. Перед нагнетанием ротационным водокольцевым компрессором 17 воздух очищают от механических примесей на висциновом фильтре 16, а после компрессора освобож­дают от влаги последовательно в водоотделителе 18, влагоотделителе 19 и конденсаторе 20. Сжатый и осушенный воздух нагревают в теплообменнике 21 до температуры 60—80°С и затем очищают от микрофлоры на общем головном фильтре 22, заполненном базаль­товым волокном. После головного фильтра воздух поступает в коллектор 23 и дополнительно очищается на индивидуальных филь­трах 24 у маточника и 25 уферментатора, которые также заполне­ны базальтовым волокном.

Для бесперебойного воздухоснабжения необходима установка двух головных фильтров. Перезарядку головного фильтра базаль­товым волокном проводят 1—2 раза в год, после чего его стерили­зуют острым паром при избыточном давлении 0,15 МПа в течение 4—6 ч и затем полностью отдувают влагу горячим воздухом темпе­ратурой 110—114С. Индивидуальные фильтры перезаряжают че­рез 5—10 ферментации. В случае переброса питательной среды в фильтр или нестерильности ферментации проводят внеочередную перезарядку. Индивидуальные фильтры стерилизуют одновременно с маточниками и ферментаторами острым паром в течение 2 ч при избыточном давлении около 0,2 МПа. Влагу удаляют из фильтров продуванием воздуха.

За стерильностью воздуха, поступающего в аппараты, ведут си­стематический контроль. С этой целью колбу вместимостью 0,5 л со стерильным мясопептонным бульоном (100—150 мл) в стериль­ных условиях подсоединяют к специальному пробному кранику на воздуховоде и продувают воздух через бульон в течение 10—12 ч допуская сильного вспенивания). По истечении этого времени колбу отсоединяют и ставят в термостат при 37°С на 48 ч. Появля­ющееся помутнение свидетельствует о нестерильности воздуха.

Во время культивирования гриба в ферментаторах температура питательной среды 30—32°С поддерживается автоматическим регулированием подачи воды в рубашку аппарата. Аэрацию и перемешивание мешалкой (частота вращения около 200 об/мин) про­водят непрерывно с момента окончания засева и до конца фермен­тации. Количество подаваемого воздуха 15—20 м³/(м³-ч). Пробоотборник и нижняя сливная коммуникация находятся под паровой защитой. Продолжительность ферментации 48—55 ч.

Отработавший воздух из ферментатора по патрубку в крышке выбрасывается через скруббер 26 в атмосферу. В скруббере воздух очищается от спор и других взвешенных частиц.

Готовая культура насосом 15 перекачивается в сборники при осахаривателях разваренной массы. Освободившийся ферментатор моют и стерилизуют при 120°С в течение 2 ч.

В процессе ферментации для микробиологического и биохими­ческого контроля развития культуры отбирают пробы (с соблюде­нием условий стерильности) вначале через 24 ч после засева, а за­тем через каждые 12 ч роста. Готовая культура должна иметь ак­тивность не менее: по а-амилазе 4—5 ед./мл и по глюкоамилазе — 5—6 ед./мл.

Производственное культивирование других микроорганизмов проводится по аналогичной технологической схеме и отличается только составом питательной среды, расходом воздуха, частотой вращения мешалки в ферментаторе, продолжительностью культи­вирования и активностью готовой культуры.

Так, например, для культивирования Asp. awamori 466 исполь­зуют кукурузное сусло, осахаренное солодом. Разваривают куку­рузную муку при мягком режиме. Концентрация сухих веществ 20% Стерилизация питательной среды производится при 125°С в течение 30—40 мин. Количество посевного материала — 3% к объему питательной среды.

Ферментация производится 120—160 ч при 35°С при работе двухъярусной мешалки с частотой вращения 150—170 об/мин, рас­ход воздуха 20—30 м³ на 1 м³ аэрируемой среды в час, конечный рН 3,5. Активность готовой культуры — 200—250 ед. ГлА/мл.

На рис. 59 приведена технологическая схема непрерывного культивирования плесневых грибов на установке, предложенной ВНИИПрБ и испытанной с положительным результатом на Мичуринском заводе.

Установка состоит из батареи ферментаторов, соединенных переточными трубами. Выращенную в маточнике посевную культуру гриба передают в головной ферментатор, в который одновременно поступает готовая питательная среда. По заполнении первого фер­ментатора культура самотеком поступает во второй, затем в тре­тий и т. д. С помощью лоткового делителя питательную среду можно распределить между первым и вторым головными ферментаторами и таким образом, регулировать развитие культуры, что, кроме того, достигается и скоростью притока.

Основная трудность в осуществлении непрерывного культивиро­вания — большая опасность инфицирования, и необходимость час­тых остановок для проведения профилактической стерилизации.