Выбор состава питательных сред

Многие из применяемых в промышленности продуцентов являются хемогетеротрофами, потребности которых в энергии и углероде удовлетворяются простыми сахарами. В промышленности в качестве источников энергии и углерода часто применяют неочищенные сахара, а также те или иные полупродукты, например, свеклосахарную или кукурузную мелассу (50-70% ферментируемых сахаров), сыворотку или отходы консервной промышленности. Дрожжи получают на сульфатно-спиртовой барде, побочном продукте бумажного производства.

Для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов питательные среды должны соответствовать следующим требованиям:

1. Содержать все элементы, из которых строится клетка: макроэлементы (углерод, азот, кислород, сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо) и микроэлементы (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт, никель, ванадий, хлор, натрий, кремний и др.). Все элементы должны находится в удобоусвояемых конкретным микроорганизмом соединениях. источником углерода могут быть разнообразные органические соединения: углеводы, многоатомные спирты, органические кислоты, аминокислоты, белки и др. Источником азота служат аммонийные соединения, аминокислоты, пептиды, белки. Источником остальных макроэлементов являются неорганические соединения – соли фосфорной и других кислот. Микроэлементы поступают в питательную среду с органическими субстратами, солями и водой. Витамины (особенно группы В) и другие факторы роста вносят в среду в составе органических субстратов или в виде чистых веществ.

2. Иметь достаточную влажность (не менее 20% воды).

3. Концентрация солей в среде должна обеспечивать изотонию, т.е. соответствовать концентрации солей в микробной клетке (для большинства микроорганизмов – 0,5%; галофильных – 3%).

4. Концентрация водородных ионов (pH) среды должна быть оптимальной для выращиваемого микроорганизма (диапазон pH 4,5-8,5).

5. Окислительно-восстановительный потенциал (Eh среды должен соответствовать потребностям микроорганизма: для анаэробов – 0,120-0,60 В, для аэробов – более 0,80 В.

6. питательная среда должна быть стерильной.

Для производства фармацевтической продукции применяются натуральные, полусинтетические и синтетические питательные среды. Натуральные среды получают из животных тканей, микроорганизмов, растений, овощей, фруктов, зерна и других продуктов, а также отходов производства. Они содержат весь комплекс необходимых компонентов, но мало пригодны для крупнотоннажных производств из-за непостоянства состава. Комплексные натуральные среды, состоящие из биошрота, пшеничных отрубей широко используются для получения ферментов.

Первоначально микроорганизмы и клетки тканей культивировали на естественных средах, представляющие собой экстракты растительного и животного материала (виноградный сок, молоко, пептон, сыворотка). подобные среды удобны, так как содержат все источники, необходимые для роста и размножения, но они обладают одним недостатком – неопределенностью содержания макро- и микроэлементов.

Полусинтетические среды состоят из соединений известной химической природы и комплекса неопределенных веществ. Это жидкие парафины, древесные гидролизаты, меласса, отруби, кукурузный экстракт и другие отходы пищевых и непищевых производств (антибиотики, аминокислоты, дрожжи, ферменты). Синтетические среды состоят из соединений известной химической природы: метанола, этанола, природного газа и метана.

Углеродсодержащее сырье. Наиболее характерным углеродсодержащим сырьем являются углеводы. Углеводы – одна из основных частей питательной среды для выращивания микроорганизмов. Они используются для синтеза клеточных структур и одновременно являются источником энергии. Для промышленного биосинтеза наиболее часто используют глюкозу и крахмал, гидролизаты различных отходов переработки сельскохозяйственного сырья (подсолнечная лузга, кукурузные кочерыжки, древесная щепа и др.).

Выбор источника углерода в биотехнологии белковых веществ, липидов и аминокислот имеет очень большое значение. Он не только представляет пути обмена веществ данного микроорганизма, но и часто предполагает состав остальных компонентов среды и даже технологию и аппаратурное оформление производства целевого продукта, в особенности, если предполагается использование труднодоступного для микроорганизмов субстрата, нуждающегося в предварительной обработке.

Азотсодержащее сырье. Биосинтез многих биологически активных веществ осуществляют на питательных средах сложного, а зачастую непостоянного химического состава. В них различные источники азота могут быть представлены белками, пептидами или свободными аминокислотами. При промышленной ферментации используют кукурузный экстракт, соевую муку или гидролизат дрожжей. Кукурузный экстракт содержит весь комплекс аминокислот, но их количественный состав может значительно меняться от партии к партии.

Белковыми веществами богата соевая мука. Она также, как и кукурузный экстракт, содержит все аминокислоты, однако в основном они связаны в идее белков. При оценке природных веществ (соевая мука, кукурузный экстракт и т.п.) следует принимать во внимание, что их воздействие на направленный процесс обмена веществ микроорганизмов обусловлено не только наличием белков и аминокислот, но и присутствием наряду с ними углеводов, нуклеиновых кислот, микроэлементов, органических кислот и других соединений.

Из минеральных азотсодержащих веществ наиболее часто применяют аммонийный соли серной, соляной или азотной кислот. Сульфат аммония пригоден для биосинтеза многих соединений.

Потребность в тех или иных азотсодержащих соединениях определяется физиологическими возможностями микроорганизмов. Часть микроорганизмов способны синтезировать аминокислоты на основе компонентов среды с использованием азота неорганических соединений, другие требуют ведения в состав среды готовых форм аминокислот или других органических источников азота.

Содержание азота в питательно среде должно быть сравнительно высоким, так как биомасса, например, дрожжей, состоит приблизительно на 45-55% сухой массы из белка, в которой около 6% азота. Поэтому для выращивания дрожжей требуется до 100 мг азота на 1 л питательной среды.

Иногда продуценты биологически активных веществ нуждаются в отдельных аминокислотах, реже – во всех 20. Органические азотсодержащие соединения и аммонийные азот обычно легко усваиваются микроорганизмами, нитраты – медленнее, так как азот нитратов должен быть сначала восстановлен и только потом реализован клеткой в обмене веществ.

Недостаток азота в питательной среде приводит к так называемому «ожирению» клеток, т.е. к повышению содержания в них липидов за счет уменьшения белковой или аминокислотной фракций.

Процесс подбора питательной среды для выращивания микроорганизмов и для проявления им максимальной биосинтетической активности целевого продукта очень трудоемкий и сложный, требующий знаний физиологии микроорганизма. Разработка или выбор среды может осуществляться в течение нескольких месяцев или лет в зависимости от сложности поставленной задачи и степени изученности данного микроорганизма.

Принципиально состав каждой питательной среды для каждого микроорганизма может быть определен двумя способами: методом многостадийного эмпирического подбора или же с использованием математических методов планирования эксперимента.

Первый способ самый распространенный. Обычно на основе изучения физиологических особенностей микроорганизма определяют качественный состав среды, а количество компонентов устанавливают экспериментальным путем, когда один компонент среды изменяют в определенных пределах, а остальные оставляют на неизменном уровне. Этот метод является надежным, но довольно длительным.

При использовании математических методов планирования эксперимента можно значительно быстрее найти и научно обосновать оптимальный состав питательной среды. Математическое планирование экспериментов принимают при изучении новых продуцентов фармацевтических препаратов.

Существует понятие «минимальных» сред, содержащих лишь источники питания, необходимые для роста и «богатые» среды, которые содержат дополнительные вещества в форме аминокислот, витаминов (т.е. факторы роста). Обогащение сред для культивирования приводит к увеличению скорости роста и изменению ферментного состава биомассы.

Если основной целью биотехнологического процесса является синтез лекарственного препарата, то к среде добавляют определенные вещества – предшественники или его близкие аналоги, которые включаются в молекулу продукта. Так, в производстве пенициллина и витамина В₁₂ в качестве предшественников используют фенилуксусную кислоту.

Различают питательные среды общего назначения (универсальные) и специальные питательные среды. Питательные среды общего назначения пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и применяются в качестве основы для приготовления специальных питательных сред. К ним относятся, например, мясо-пептонный бульон, агар, бульон Хоттингера, агар Хоттингера и др. Специальные питательные среды предназначены для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изучения их свойств и хранения.