Структура и конформации нуклеиновых кислот

В клетках присутствуют два типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК). Основная задача молекулярной биофизики состоит в изучении структурных конформационных изменений нуклеиновых кислот. До недавнего времени ДНК представлялась весьма жесткой и мало изменчивой макромолекулой. В действительности, двойная спираль ДНК обладает изменчивой и гибкой структурой, что очень важно для выполнения биологических функций в клетке.

Строение НК. Нуклеиновые кислоты подобно белковым цепям являются линейными неразветвленными цепями и в них подобно тому, как в белках фигурируют 20 аминокислотных остатков, так в ДНК и РНК фигурируют 4 азотистых основания. Но это правило менее строгое и наряду с каноническими основаниями встречаются производные от них - минорные основания. В ДНК фигурируют цитозин (Ц), тимин (Т), аденин (А), гуанин (Г); в РНК - цитозин (Ц), гуанин (Г), аденин (А), урацил (У).

Для всех азотистых оснований характерно наличие центрального кольца по типу бензольного. Наличие двойных связей приводит к наличию делокализованных электронов, принадлежащих всему кольцу.

Пуриновые и пиримидиновые основания ДНК несут генетическую информацию, тогда как сахарные и фосфатные группы выполняют структурную роль.

Первичная структура нуклеиновых кислот.

Под первичной структурой нуклеиновых кислот понимают - последовательность нуклеотидов в полинуклеотидной цепи ДНК и РНК. Нити НК представляют непрерывную цепь ковалентно соединенных фосфодиэфирными связями фосфатных групп с остатками сахара. В каждом нуклеотиде сахар соединен с помощью гликозидной связи с азотистым основанием. Ориентация оснований к дезоксирибозе в ДНК описывается углом поворота. Возможно также вращение вокруг эфирной связи. Конформационная подвижность в полинуклеотидной цепи сводится к вращению вокруг этих связей.

Почти все РНК состоят из одной полинуклеотидной цепи. Исключение составляют некоторые опухолеродные вирусы, существующие в виде димеров из двух одинаковых цепей. Длина цепей РНК изменяется в широких пределах - от 80 звеньев для самых коротких тРНК до 2*105 звеньев в длинных РНК.

Большинство молекул ДНК состоит из двух полинуклеотидных: цепей, закрученных одна вокруг другой. Цепи обладает полярностью, т. е. в ДНК они расположены антипараллельно. Одни природные ДНК являются кольцевыми, другие – линейными. Самые короткие ДНК содержат несколько тысяч звеньев, тогда как высокомолекулярные - до 108 звеньев.

Первичная структура ДНК была расшифрована в 1962 году, и сегодня существует правило синтеза полинуклеотидных цепей. Одно из нескольких экспериментальных правил, справедливых для ДНК, - правило Чаргаффа (с точностью 3 - 5%). Закономерности Чаргаффа сводятся к следующему:

• молярное соотношение аденина к тимину равно 1 (А = Т, или А/Т = 1);

• молярное соотношение гуанина к цитозину равно 1 (Г= Ц, или Г/Ц = 1);

• сумма пуриновых нуклеотидов равна сумме пиримидиновых нуклеотидов;

• в ДНК из разных источников отношение Г + Ц/А + Т, называемое коэффициеитом специфичности, неодинаково.

В ДНК некоторых видов преобладает суммарное количество аденина и тимина, это так называемые АТ-тип ДНК. АТ-тип преобладает у всех позвоночных и беспозвоночных животных и высших растений. ГЦ-тип (с суммарным преобладанием гуанина и цитозина) встречается у микроорганизмов, хотя некоторые из них могут иметь и AT-тип. В связи с этим Е. Чаргафф выдвинул положение о видовой специфичности ДНК по нуклеотидному составу.

В 70-х гг. XX в. с открытием ферментов рестриктаз, «разрезающих» молекулы ДНК в строго определенных точках, А. Максимом и В. Гилбертом был разработан метод ссквенирования, позволяющий опреде­лять последовательности до 1000 нуклеотидов. С помощью электрофореза ДНК разделяется на фрагменты, отличающиеся по длине даже на один нуклеотид. Это позволяет точно локализовать место расщепления ДНК простым измерением длины получающихся фрагментов.

Вторичная структура нуклеиновых кислот.

ДНК. Решающее значение для открытия пространственной структуры ДНК имели рентгенографические исследования кристаллических препаратов ДНК, проведенные М.Уилкинсом и Р.Франклин. При облучении рентгеновскими лучами λ ориентированных кристаллических нитей ДНК на фотопленке регистрируется рентгенограмма. Положение дифракционных максимумов (дифракционных рефлексов) на рентгенограмме соответствует условию Вульфа-Брэгга:

b*sin

где в - постоянная решетки (расстояние между упорядоченными плоскостями); θ -угол дифракции; m =1, 2, 3, … - порядок дифракции.

Применив правила Чаргаффа и использовав молекулярные модели нуклеотидов, Уотсон и Крик просмотрели вое возможные комбинации четырех оснований для того, чтобы получить компактную и устойчивую пространственную структуру ДНК. На основании этих исследований они сделали важное заключение, что ДНК представляет собой двойную спираль - две полинуклеотидные нити, идущие в противоположных направлениях и закрученные одна вокруг другой. Главное достоинство модели Уотсона-Крика состоит в установлении принципа комплементарности, или дополнительности. Связь двух нитей ДНК осуществляется с помощью комплементарных пар А—Т и Г—Ц (уотсон-криковские пары). Таким образом; правила Чаргаффа получают строгое объяснение. Благодаря принципу комплементарности всегда выполняется равенство пуриновых и пиримидиновых оснований в ДНК. Комплементарные пары А—Т и Г—Ц в ДНК располагаются на оптимальном расстоянии l = 1,085 нм, когда возможно «замыкание» между ними водородных: связей. Комплементарная пара А—Т стабилизирована двумя водородными связями, пара Г—Д - тремя водородными связями.

Благодаря способности нуклеотидов к спариванию, образуется жесткая, хорошо стабилизированная двух цепочечная структура, обладающая следую­щими свойствами.

• Сахарофосфатные остовы двух цепей образуют правозакрученную спи­раль с общей осью и диаметром 0,2 нм. В спирали существуют две борозд­ки — большая и малая. На каждый виток спирали приходится 10 пар осно­ваний.

• Сахарофосфатные остовы двух полинуклеотидных цепей, расположен­ные снаружи, связаны между собой водородными связями между отходящими от них вовнутрь азотистыми основаниями. Плоскости оснований перпендику­лярны оси спирали и отстоят друг от друга на 0,34 нм.

• Гидрофобные взаимодействия между плоскостями ароматических колеи оснований стабилизируют структуру, преодолевая силы электростати­ческого отталкивания между отрицательно заряженными фосфатными груп­пами.

• Две цепи антипараллельны, т. е. по своему химическому строению они ориентированы в противоположных направлениях. Антипараллельная направленность имеет важное биологическое значение при репликации и транс­крипции ДНК.

Существует четыре формы ДНК, которые различаются диаметром и шагом спирали, числом пар оснований в витке, углом наклона плоскости оснований по отношению к оси молекулы.

1. А-форма ДНК.

2. В-форма ДНК.

3. С-форма.

4. Z-форма ДНК.

Рассмотрим В-форму ДНК классическая уотсон-криковская двойная спираль. На один виток спирали приходится 10 пар оснований, шаг спирали 3,4 нм, диаметр 1,8 нм, угол наклона к оси 0°. В этой правозакрученной спирали плоскости пар оснований перпендикулярны оси спирали. Схематически двойная спираль представляет собой винтовую лестницу. Угол скручивания двойной опирали (φ) соответствует повороту комплементарных пар, следующих вдоль оси спирали. Для В-формы φ = 360˚/10 = 36˚. В-форма, по-видимому, благоприятна для процесса репликации.

В А-форме на один виток приходится 11 пар оснований, шаг спирали 2,8 нм, угол наклона на плоскости оснований к оси составляет 20°. При таком расположении сохраняется правая двойная спираль, однако в отличие от B-формы основания уже не перпендикулярны оси, а находятся под другим углом = 20°. Форма А является предпочтительной для процессов транскрипции. Образуется при дегидратации В-формы ДНК.

Форма С, выявлен­ная у ряда вирусов и в составе надмолекулярных структур хроматина, имеет 9,3 пары оснований в витке с углом наклона — 5°.

Z-форма ДНК: левозакрученная двухспиральная форма ДНК, содержащая около 12 остатков на один оборот. Эта структура предложена Александром Ричем. Z-Форма ДНК — наименее скрученная (12 пар оснований на виток). Она представляет собой левозакрученную двойную спираль, в которой фосфоэфирный остов расположен зигзагообразно вдоль оси.). Которая может образовываться в участках В-ДНК, богатых GC, расположение нуклеотидов совершенно иное: двойная спираль скручена влево, а остов имеет характерную зигзагообразную форму. Z-Форма обладает толь­ко одной бороздкой. Как известно, в бороздках ДНК регуляторные белки мо­гут специфически взаимодействовать с определенными атомами нуклеиновых оснований, т.е. «узнавать» конкретные нуклеотидные последовательности без нарушения комплементарных взаимодействий в структуре двойной спирали. Тем самым регуляторные белки могут осуществлять контроль экспрессии генов. Некоторые белки, снизывающиеся в большой или малой бороздках формы, вероятно, не способны связываться с Z-формой. В связи с этим Z-форма, возникающая, как правило, при высоких концентрациях солей, спермина, спермидина, при метилировании остатков дезоксицитидина, при высоком содержании отрицательных супер витков в молекуле ДНК, может участвовать регуляции экспрессии генов.

Описанные формы ДНК способны к взаимно обратимым переходам в зависимости от условий среды.

Третичная структура ДНК.

У всех живых организмов двухспиральные молекулы ДНК плотно упакованы с образованием сложных трехмерных структур.

Двухцепочечные ДНК прокариот, имеющие кольцевую ковалентно-замкнутую форму, образуют левые (-) суперспирали. Суперспирализация прежде всего необходима для «упаковки» громадной молекулы ДНК в малом объеме клетки. Например, ДНК Е. coli имеет длину более 1 мм, в то время как длина клетки не превышает 5 мкм. Помимо этого, суперспирализация ДНК, облегчающая ее расплетение, обеспечивает начало репликации и транскрипция.

Третичная структура ДНК эукариотических клеток также образуется путем суперспирализации, но не свободной ДНК, а ее комплексов с белками хромосом.

Суперспирализация, по-видимому, выполняет две биологические функции. Во- первых, суперспирализованная ДНК имеет более компактную форму, чем релаксированная ДНК такой же длины. Суперспирализация может играть определенную роль в упаковке ДНК. Во-вторых, Суперспирализация может влиять на степень расплетания двойной спирали и, следовательно, на ее взаимодействия с другими молекулами. Точнее, отрицательная суперспирализация может приводить к раскручиванию двойной спирали. Интересно отметить, что почти все кольцевые молекулы ДНК, встречающиеся в природе, отрицательно суперспирализованы.

Ядерный хроматин содержит ДНК, гистоновые и негистоновые белки, не­большое количество РНК. В пространственной организации хромосом можно выделить несколько уровней. Первый уровень — нуклеосомный. Нуклеосомная нить образуется при взаимодействии ДНК с белками-гистонами. Гистоны представляют собой простые белки с молекулярной массой 14—20 kDa, в аминокислотном составе которых преобладают аргинин и лизин, глицин и цистеин. Преобладание лизина и аргинина придает гистонам щелочной характера и обеспечивает их способность взаимодействовать с кислотными группами ДНК. Во всех типах эукариотических клеток обнаружено 5 классов гистоном (H1, Н2, НЗ, Н4, Н5), различающихся по содержанию (%) основных аминокислот, обусловливаюшему их физико-химические свойства (электрофоретическую подвижность).

В результате нуклеосомной организации хроматина двойная спираль ДНК диаметром 2 нм приобретает диаметр 10—11 нм и укорачивается примерно в 7 раз.

Вторым уровнем пространственной организации хромосом является обра­зование из нуклеосомной нити хроматиновой фибриллы диаметром 20— 30 нм, что обеспечивает уменьшение линейных размеров ДНК еще в 6—7 раз.

Третичный уровень организации хромосом обусловлен укладкой хромати­новой фибриллы в петли. В образовании петель принимают участие негистоновые белки, узнающие специфические нуклеотидные последовательности в ненуклеосомной ДНК и фиксирующие образование петель. Участок ДНК, со­ответствующий одной петле, содержит от 20 000 до 80 000 пар нуклеотидов и, вероятно, представляет домен ДНК, соответствующий единице транскрип­ции. В результате такой упаковки линейные размеры ДНК уменьшаются при­мерно в 200 раз. Петлеобразная доменная организация ДНК, называемая ин­терфазной хромонемой. может подвергаться дальнейшей компактизации, сте­пень которой меняется в зависимости от фазы клеточного цикла.

Конформации ДНК.

Конформационные перестройки в ДНК возможны за счет небольших изменений в фуранозном кольце дезоксирибозы. С помощью рентгеноструктурного анализа установлено, что пятичленное кольцо сахара не является абсолютно плоским. Атом С2 и С3 могут отклоняться из плоскости кольца на 0,03-0,06 нм. Если атом С2 отклоняется из плоскости кольца в сторону С5, то образуется С2-эндоконформации. Отклонение С3 из плоскости кольца вызывает образование СЗ-эндоконформации. Такие небольшие конформационные перестройки сахарного кольца вызывают изменение угла и ориентацию азотистых оснований по отношению к оси спирали.

Различают два семейства конформаций ДНК. Если сахар находится в С2-эндоконформации, наблюдается В-семейство. Характерная особенность его состоит в том, что угол χ = 2-6˚ и комплементарные пары располагаются почти перпендикулярно к оси спирали. К В-семейству относятся В-, С-, Z-формы ДНК. С СЗ-эндоконформацией. фуразного кольца связано А-семейство. В этой конформации угол χ увеличивается, и комплементарные пары располагаются под углом примерно 20° к оси спирали. В А-семейство попадают такие конформации нуклеиновых кислот: А-форма ДНК, А-форма РНК.

Представленные выше результаты свидетельствуют о том, что двойная спираль проявляет динамичные свойства. ДНК может принимать разнообразные формы и взаимодействовать разными способами с другими молекулами клетки. Фиксированная структура уотсон-криковских пар оснований допускает большое разнообразие форм двойной спирали.

Функции ДНК.

В последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК закодирована генетическая информация. Основными функциями ДНК являются, во-первых, обеспечение воспроизводства самой себя в ряду клеточных поколений и поколений организмов, во-вторых, обеспечение синтеза белков. Эти функции ДНК обусловлены тем, что молекулы ДНК служат матрицей в первом случае для репликации, т. е. копирования информации в дочерних мо­лекулах ДНК, во втором — для транскрипции, т. е. для перекодирования ин­формации в структуру РНК.

Физико-химические свойства ДНК.

Различные факторы, нарушающие водородные связи (повышение температуры выше 80°С, изменение рН и ион­ной силы, действие мочевины и др.), вызывают денатурацию ДНК, т. е. изме­нение пространственного расположения цепей ДНК без разрыва ковалентных связей. Двойная спираль ДНК при денатурации полностью или частично раз­деляется на составляющие ее цепи. Денатурация ДНК сопровождается усиле­нием оптического поглощения в УФ-области пуриновых и пиримидиновых оснований. Это явление называют гиперхромным эффектом. При денатурации уменьшается также высокая вязкость, присущая растворам нативной ДНК, При восстановлении первоначальной двухспиральной структуры ДНК, в ре­зультате ренатурации, поглощение при 260 нм азотистыми основаниями вследствие их «экранированности» уменьшается. Это явление называют гипохромным эффектом.

«Расплетение» каждой ДНК на составляющие ее цепи осуществляется в пределах определенного интервала температур. Средняя точка этого интервала называется температурой плавления. Температура плавления ДНК зависите стандартных условиях (определенная рН и ионная сила) от соотношения азо­тистых оснований. Г—Ц-пары, содержащие три водородные связи, более прочные, поэтому, чем больше в ДНК содержание Г—Ц-пар, тем выше темпе­ратура плавления.