Восстановление нитратного азота в растениях.

В большинстве почв, особенно окультуренных, довольно активно происходит процесс нитрификации, в ходе которого аммонийная форма азота, образующаяся в почве при распаде органических остатков, а также внесённая в виде удобрений, превращается в нитраты. Поэтому большая часть азота, поступающая в растения при корневом питании представлена нитратами, которые очень легко усваиваются растениями, включаясь в синтез аминокислот. В связи с тем, что в составе аминокислот азот находится в аминной форме, нитратный азот в растениях, прежде чем включиться в состав аминокислот, подвергается восстановлению в аммонийную форму с помощью специальных ферментных систем.

Восстановление нитратного азота в аммонийный в клетках растений, водорослей, грибов и бактерий осуществляется в два этапа. На первом этапе под действием фермента нитратредуктазы происходит превращение нитратов в нитриты, а затем нитриты с участием фермента нитритредуктазы восстанавливаются с образованием аммонийной формы азота, которая используется для синтеза аминокислот и амидов. Схематически эти процессы можно представить следующим образом:

+5 2ē +3 6ē –3

NO₃^‾ ¾® NO₂^‾ ¾® NH₄⁺

Нитратредуктазы высших растений, зелёных водорослей и грибов (1.6.6.1; 1.6.6.2; 1.6.6.3) представляют собой металлофлавопротеиды с молекулярными массами 200-330 тыс., включающие два типа субъединиц: имеющие флавиновые группировки (ФАД, ФМН) и содержащие молибденовый кофермент. Донором электронов для восстановления нитратного азота у растений служит НАД×Н, у грибов - НАДФ×Н. От восстановленных пиридиндинуклеотидов электроны и протоны переходят на флавиновую группировку нитратредуктазы. Затем электроны передаются на цитохром в₅₅₇, служащий в составе фермента промежуточным переносчиком электронов от флавинового на молибденовый кофермент, а протоны высвобождаются и могут взаимодействовать с анионами кислорода, которые образуются при восстановлении нитратного азота.

Молибденовый кофермент содержит катионы молибдена, лабильно связанного с ароматической группировкой, которая нековалентно присоединяется к белковой части фермента. Катионы молибдена, обратимо изменяя степень окисления, способны акцептировать электроны от цитохрома в₅₅₇ и передавать их на азот нитрата, который связывается с активным центром фермента. В результате восстановления азота нитрат превращается в нитрит, а высвобождающийся анион кислорода О^2- соединяется с протонами, образуя молекулу воды. Механизм восстановления нитратов до нитритов под действием нитратредуктазы может быть представлен в виде следующей схемы:

Суммарно процесс восстановления нитратов в растениях под действием фермента нитратредуктазы может быть выражен следующим уравнением:

NO₃‾ + НАД×Н + Н⁺ ¾® NO₂^‾ + НАД⁺ + Н₂О

У бактерий нитратредуктазы представлены относительно низкомолекулярными белками (70-180 тыс.), не содержащими флавиновых группировок. Донором электронов у них служит восстановленный ферредоксин или его аналоги. Нитратредуктазы бактерий тесно связаны с клеточными мембранами, тогда как у высших растений, зелёных водорослей и грибов эти ферменты локализованы в цитоплазме.

У растений наиболее высокая нитратредуктазная активность обнаруживается в меристематических тканях. У большинства растений при активном фотосинтезе и достаточном количестве углеводов, являющихся источниками образования НАД×Н, процесс восстановления нитратов практически полностью происходит в корнях. Однако при недостатке света и низких температурах, ослабляющих синтез углеводов, а также избыточном азотном питании значительная часть нитратов поступает в вегетативную часть растений и подвергается восстановлению в листьях. Вместе с тем известны растения, у которых практически не обнаруживается нитратредуктазной активности в корнях. У них превращение нитратного азота в аммонийный осуществляется в основном в листьях. К таким растениям относятся свёкла, хлопчатник, марь, дурнишник и др.

Нитратредуктаза – типичный индуцибельный фермент. Его активность резко возрастает при поступлении в растения нитратов вследствие того, что происходит индукция синтеза фермента. Когда же концентрация нитратов в клетках растений уменьшается, синтез ферментного белка прекращается и нитратредуктазная активность снова понижается до исходного уровня. Кроме нитратов, индукторами синтеза нитратредуктазы могут быть цитокинин и органические нитросоединения, то есть возможна индукция синтеза этого фермента под воздействием химических регуляторов. В то же время катионы аммония подавляют в растениях синтез нитратредуктазы. В опытах показано, что индукция синтеза нитратредуктазы в присутствии нитратов происходит на свету, а в темноте усиливается деградация этого фермента.

Активность фермента нитратредуктазы в значительной степени определяется присутствием в физиологической среде окислителей и восстановителей. В восстановительных условиях большая часть активного фермента, находящегося в окисленной форме, переводится в неактивное (восстановленное) состояние, в результате нитратредуктазная активность в тканях растений понижается. Такое явление, например, наблюдается при переносе растений в темноту. Однако при освещении растений очень быстро осуществляется фотореактивация фермента, то есть перевод его из восстановленной в окисленную форму, вследствие чего процесс восстановления нитратов снова активируется.

Восстановление нитритов в аммонийную форму азота катализируют ферменты нитритредуктазы (1.6.6.4.; 1.7.99.3). У растений и фотосинтезирующих водорослей эти ферменты представляют собой сравнительно низкомолекулярные белки (60-70 тыс.), которые содержат в качестве активных группировок железо-серный центр ( 4Fe4S) и сирогем (железотетрагидропорфирин). Донором электронов служит восстанов-ленный ферредоксин, поэтому нитритредуктазы у указанных организмов локализованы в хлоропластах.

Ферредоксин передаёт электроны на железо-серный центр нитритредуктазы, который далее восстанавливает сирогем, способный передавать электроны на атомы азота нитритов, в результате происходит присоединение к ним протонов и образование аммонийной формы азота. А высвобождающиеся анионы кислорода О^2-, реагируя с катионами Н⁺, дают молекулы воды. Перенос электронов от восстановленного ферредоксина на нитриты с участием нитритредуктаз можно показать в виде следующей схемы:

Fd_восст. ¾® 4Fe4S ¾® сирогем ¾® NO₂^‾

нитритредуктаза

Суммарное уравнение процесса восстановления нитритов под действием нитритредуктазы можно записать в следующем виде:

NO₂^‾ + 6Fd_восст. + 8Н⁺ ¾® NH₄⁺ + 6 Fd_окисл. + 2Н₂О

Каталитическая активность нитритредуктаз в 5-20 раз превышает активность нитратредуктазы, поэтому нитриты, как правило, не накапливаются в растениях. В корнях нитритредуктазная активность локализована в пропластидах и донорами электронов для восстановления нитритов здесь служат восстановленные динуклеотиды НАДФ×Н.

Нитритредуктазы, как и нитратредуктазы, – индуцибельные ферменты. Индукцию их синтеза вызывают нитраты, а репрессию синтеза – катионы аммония.

В отличие от нитритредуктаз фотосинтезирующих организмов аналогичные ферменты бактерий и грибов представляют собой более высокомолекулярные формы, содержащие флавиновые коферменты. Донорами электронов для них служат восстановленные динуклеотиды НАД×Н и НАДФ×Н.

Существующие разновидности растений очень сильно различаются по способности восстанавливать нитраты, которая зависит главным образом от уровня нитратредуктазной активности, тогда как нитритредуктазы – каталитически более активные ферменты. Общий уровень нитратредуктазной активности определяется, с одной стороны, интенсивностью синтеза ферментного белка, а с другой стороны, – каталитической способностью фермента.

Для усиления синтеза нитратредуктазы в растительных тканях проводятся молекулярно-генетические исследования, связанные с воздействием на регуляторные гены, оказывающие влияние на скорость синтеза ферментного белка. Одновременно с этим ведётся поиск химических регуляторов, усиливающих действие генетической системы синтеза фермента нитратредуктазы. В целях повышения каталитической активности нитратредуктазы в растительных тканях разрабатываются на молекулярном уровне способы введения в геном растений генов из клеток бактерий, кодирующих более активные молекулярные формы нитратредуктазы. Кроме того, в результате применения методов белковой инженерии предпринимаются попытки оптимизации структуры фермента путём замены отдельных нуклеотидов в структурных генах нитратредуктазы, что предопределяет синтез видоизменённого белка с повышенной каталитической активностью.

Цель таких работ – повысить эффективность использования нитратного азота для синтеза азотистых веществ и таким образом увеличить продуктивность растений. Вторая важная задача – понизить накопление нитратов, так как они потенциально опасны для человека и животных. Нитраты очень легко восстанавливаются в нитриты неферментативным путём, а последние взаимодействуют с гемоглобином, переводя его в окисленную форму – метгемоглобин, не способный осуществлять функцию транспорта кислорода, в результате чего ухудшается обеспеченность организма кислородом. Кроме того, нитриты являются химическими предшественниками нитрозоаминов, обладающих мутагенным и канцерогенным действием.

Известны группы растений, имеющие природно невысокий уровень нитратредуктазной активности, вследствие чего они накапливают высокие концентрации нитратов. К таким видам относятся растения семейства тыквенные, шпинат, редька и др. Однако у большинства растений повышение содержания нитратов наблюдается при определённых неблагоприятных условиях выращивания, связанных с недостатком световой энергии, низкой температурой, недостатком фосфора, калия, ряда микроэлементов, избыточными дозами азотных удобрений. Поэтому для каждой группы растительных продуктов установлена предельно допустимая концентрация нитратов.

При недостатке света ослабляются процессы фотосинтеза и дыхания, в результате чего понижается скорость образования восстановленных динуклеотидов и восстановленного ферредоксина, являющихся донорами электронов для восстановления нитратов, поэтому значительная часть нитратов остаётся невосстановленной и не используется для синтеза азотистых веществ растений. Аналогичное явление наблюдается в условиях пониженных температур, когда замедляются биосинтетические процессы, связанные с регенерацией доноров электронов для нитратвосстанавливающей системы, тогда как поступление нитратов в растения продолжается, вследствие чего их концентрация в растительных тканях увеличивается.

Заметное влияние на функционирование нитратвосстанавливающей системы растений оказывает обеспеченность их микроэлементами – молибденом, железом, магнием, марганцем, медью, которые служат активаторами нитратредуктазы, нитритредуктазы и других ферментов азотного обмена. Особенно важна роль молибдена, входящего в состав молибденового кофермента нитратредуктазы. При недостатке молибдена и других микроэлементов замедляется процесс восстановления нитратов и происходит их накопление в растительных продуктах. Ещё большее накопление нитратов в растениях наблюдается при внесении избыточных доз азотных удобрений, а также при низкой обеспеченности растений фосфором и калием, когда формируется низкий урожай, и в этих условиях даже умеренные дозы азотных удобрений могут оказаться избыточными.

Таким образом, для предотвращения накопления в растениях большого количества нитратов необходимо правильно разрабатывать технологию выращивания растений, обеспечивая оптимальное питание растений макро- и микроэлементами. Особенно важно контролировать уровень азотного питания при выращивании овощных и кормовых культур.