Конструювання та селекція рекомбінантних молекул ДНК

Характеристика загальних стратегій створення рекомбінантних ДНК: метод "дробовика" (shotgun - клонування), ПЛР - клонування, клонування із використанням гетерологічних гібридизаційних проб.

Створення рекомбінантних молекул ДНК ДНК-лігазним та конекторним методами. Використання лінкерів. Метод інсерційної інактивації маркерних генів вектора. Клонування фрагментів ДНК в певній орієнтації. Використання фосфатази для запобігання повторної циклізації ДНК вектора та рестриктаз для селекції гібридних плазмід із вставками.

Принципи конструювання культур клітин - реципієнтів для клонування рекомбінантних ДНК. Характеристика штамів E.coli -реципієнтів для рекомбінантних ДНК. Огляд методів введення екзогенної ДНК в клітину. Трансформація та трансфекція штамів E.coli.

Фенотипова селекція клонів клітин, які несуть гібридні ДНК. Селекція гібридних ДНК за допомогою гібридизаційних та імунологічних методів.

Створення і вивчення бібліотек геномів. Особливості підготовки матеріалу для отримання бібліотеки: виділення окремих хромосом, фрагментація та фракціонування ДНК. Розрахунок числа рекомбінантних клонів, необхідних для отримання репрезентативної бібліотеки генома. Формула Кларка і Карбона.

К-ДНК - бібліотеки. Ампліфікація бібліотек. Скринінг бібліотек з метою виявлення певних генів. Створення бібліотеки геному як умова його фізичного картування та секвенування. Впорядкування бібліотеки геному. "Прогулянки" по хромосомах. Методи побудови контигів та суміщених фізично-генетичних карт (енциклопедій геномів).