Генна діагностика

Відомо, що геном людини містить 3,5 млрд нуклеотидів і більш ніж 30 тис. генів. У геномі людини куклеотидні послідовності, що кодують білки, становлять лише 1,1 — 1,4% від загальної довжини ДНК. Мутації у структурних генах призводять до серйозних порушень на рівні клітин, тканин або органів. Найчастіше в результаті мутацій змінюєтеся активність певного ферменту, що спричиняє накопичення токсичного субстрату або дефіцит сполуки, необхідної для нормального функціонування клітини.Н а сьогодні відомо близько 5000 тисяч спадкових порушень обміну речовин і лише для 500 з них виявлені молекулярні причини. Розроблено тести, що визначають геиетичну схильність до спадкових захворювань, а також методи їх молекулярної діагностики. На сьогодні в Японії новонароджені проходять тест на 11 генетичних захворювань у СІНА — на7, в Україні — на 2 (фенілкетонурію і гіпотиреоз).

Сучасні методи молекулярної діагностики спадкових захворювань повинні відповідати таким вимогам:

- ефективність, продуктивність, низька вартість;

- висока специфічність (позитивна реакція тільки на молекулу- мішень);

- висока чутливість (виявлення дуже малих кількостей молекул- мішеней).

В основі молекулярної діагностики спадкових захворювань лежать імунологічні підходи або методи виявлення специфічної послідовності ДНК.

Для виявлення мутацій у генах застосовують гібридизацію нуклеїнових кислот, тобто сполучення двох комплементарних фрагментів різних молекул ДНК. З метою ідентифікації специфічної послідовності ДНК використовують зонди. Зонди можуть бути:

- молекулами ДНК або РНК;

- довгими (більш ніж 100 нуклеотидів) і короткими (менш ніж 50);

- продуктами хімічного синтезу або клонованими генами.

Одержано й охарактеризовано понад 100 різних ДНК-зондів, щодозволяють виявити патогенні штами різних бактерій, вірусів і найпростіших. Розроблено зонди для діагностики бактеріальних інфекцій людини, спричинених Legionella pneumophila (респіраторні захворювання), Salmonella typhi (харчові отруєння), Camphylobacter hyointestinalis (гастрити).

Використання методів молекулярної діагностики дозволяє виявити мінімальні концентрації ДНК патогенних мікроорганізмів у крові хворих. Так, застосування ДНК-зонда дозволяє виявити в крові хворого ДНК збудника малярії Plasmodium falciparum. Таким чином, за допомогою ДНК-зондів можна виявити будь-які патогенні мікроорганізми.

Крім зондів і ДНК-мішені, важливим компонентом системи ДНК-діагностики є метод детекції гібридних молекул. У 1983 р. Коннер розробив метод діагностики серповидноклітинної анемії, заснований на використанні гібридизації нуклеїнових кислот. Молекулярною причиною серповидноклітинної анемії є заміна валіну на глутамінову кислоту у 6-му положенні ß-ланцюга глобіна. Для діагностики захворювання використовують 2 олігонуклеотиди довжиною 19 п.н.: один комплементарний нормальному алелю ß -глобінового гена (ß A), а другий - мутантному (ßs). ДНК здорової людини (ß Aß А) гібридизується лише із рА-зондом, ДНК хворого на серповидноклітинну анемію (ß sß s) - тільки із Р зондом, а ДНК людини гетерозиготної за даним геном (р Лр в) - з обома зондами. Ця модельна система вперше продемонструвала можливість визначення генотипів за допомогою гібридизації ДНК.

У судовій медицині для ідентифікації біологічних зразків застосовують метод геномної дактилоскопії. Як зонди використовують мінісателітні ДНК людини, які не кодують білків і характеризуються великою варіабельністю. ДНК-відбиток кожної людини індивідуальний, він є набором різних за довжиною фрагментів, що відповідають мінісателії ним послідовностям генома.

Застосування методів ДНК-діагностики дозволяє виявити спадкові захворювання на стадії ембріона. З ’явилося повідомлення про використання генної діагностики з метою народження повноцінної дитини в сім’ї, члени якої страждають хворобою Альцгеймера. У штучних умовах запліднили яйцеклітину матері сперматозоїдами батька. Здійснили аналіз 15 зигот на наявність мутації в гені, що відповідає за хворобу Альцгеймера. У більшості випадків була виявлена смертельна комбінація генів, лише в одній зиготі все було в нормі. «Повноцінну» зиготу ввели в організм прийомної матері, народилася здорова дитина.

Одним із застосувань генної діагностики є виявлення генетичної схильності людини до різних видів діяльності, зокрема спорту. Основним генетичним маркером є ген ангіотензин-конвертуючого ферменту, який бере участь у регуляції артеріального тиску. Під дією ферменту відбувається синтез ангіотензину, що звужує судини і виконує функцію фактора росту, посилює процеси синтезу структурних білків у клітинах міокарда і спричиняє гіпертрофію серцевого м ’яза. Фізична активність людини залежить від наявності в її геномі певного варіанта гена. Для цього гена характерний поліморфізм (наявність або відсутність фрагмента довжиною 287 п. н. у 16-му інтроні).

У майбутньому генна діагностика дозволить визначити весь спектр генів схильності до захворювань у кожної людини, створити «генетичний паспорт» людини.