Методы приготовления препаратов хромосом.

Как уже было отмечено, в 1959 году Хангерфорд с соавторами предложили метод краткосрочного культивирования клеток периферической крови человека in vitro, а в 1960 году Ноуэлл и Хангерфорд предложили применение в качестве митогена (стимулятора клеточного деления) выделенный из семян фасоли мукополисахарид фитогемагппотинин (ФГА), позволивший индуцировать in vitro деление покоящихся Т-лимфоцитов периферической крови. В том же году Мурхед с сотрудниками предложили высушивать на воздухе раскапанную на предметные стекла клеточную суспензию делящихся клеток, что привело к созданию удобного цитогенетического метода, пригодного для диагностических целей.

К настоящему времени, благодаря новым методам цитогенетики, возможно изучение всего хромосомного набора, отдельных хромосом и их участков в клетках практически любых тканей и органов, на любой стадии клеточного цикла - в интерфазе, митозе и мейозе. В зависимости от степени пролиферативной активности клеток разных тканей in vitro и in vivo различают прямые и непрямые методы получения препаратов хромосом:

1) Прямые методы используются при исследовании тканей, обладающих высокой митотической активностью (костный мозг, хорион и плацента, клетки лимфатических узлов, ткани эмбриона на ранней стадии развития). Препараты хромосом готовятся непосредственно из свежеполученного материала после специальной обработки.

2) Непрямые методы включают получение препаратов хромосом из любой ткани после ее предварительного культивирования в течение различного периода времени.

Существует множество модификаций этих методов, однако основные этапы получения метафазных пластинок остаются неизменными:

1. Использование колхицина (колцемида) - ингибитора образования митотического веретена, который останавливает деление клеток на стадии метафазы.

2. Гипотонический шок с использованием растворов солей калия или натрия, которые вследствие разницы осмотического давления внутри и снаружи клеток вызывают их набухание и разрыв межхромосомных связей. Такая процедура приводит к отделению хромосом друг от друга, способствуя более сильному их разбросу в метафазных пластинках.

3. Фиксация клеток с использованием ледяной уксусной кислоты и этанола (метанола) в соотношении 3:1 (фиксатор Карнуа), что способствует сохранению структуры хромосом. 4. Раскапывание суспензии клеток на предметные стекла.

5. Окрашивание хромосомных препаратов.

В зависимости от стадии клеточного цикла, в которой находится исследуемая клеточная популяция возможно проведение следующих цитогенетических исследований:

• анализ отдельных хромосом и их участков в интерфазных ядрах (половой хроматин в ядрах буккального эпителия, оценка анеуплоидии, а также наличия или отсутствия относительно протяженных участков ДНК в интерфазных ядрах любой ткани методом FISH-анализа);

• профазных хромосом (анализ на стадии пахитены в сперматогенезе);

• прометафазных хромосом (высокий уровень разрешения);

• метафазных хромосом (традиционный анализ ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови, фибробластов кожи, клеток костного мозга, амниотической жидкости);

• стадий анафазы-телофазы (для регистрации специфического воздействия различных мутагенных воздействий).