Сложные методы окраски.
На препарат последовательно наносят красители различные по химическому составу и цвету, что позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать микроорганизмы.
Метод Грамма разработан датским ученым Х. Грамом в 1884 году. Он позволяет выявить структуры клеточных стенок и химические особенности бактерий. Грамположительно в фиолетовый цвет окрашиваются бактерии, у которых клеточная стенка содержит много слоев пептидогликана, соединенного поперечными мостиками в плотный чехол. Кроме того, в цитоплазме содержатся магниевые соли РНК, изоэлектрическая точка рН 2-3. Комплекс генцианвиолета и йода у этих бактерий образует химическое соединение с магниевыми солями рибонуклеиновой кислоты, которое не разрушается спиртом и не проходит через плотную клеточную стенку, поэтому цитоплазма бактерий окрашивается в фиолетовый цвет. Примеры грамположительных бактерий - стафилококки, стрептококки, микобактерии, возбудитель дифтерии и др. У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом обесцвечивается этанолом и легко выходит через клеточную стенку, имеющую тонкий слой пептидогликана, покрытого наружной плазматической мембраной, которая содержит липополисахариды и липопротеиды. Белки внешней мембраны являются поринами, через которые могут проникать гидрофильные молекулы величиной до 6000 Да, поэтому грамотрицательные бактерии не окрашиваются генцианвиолетом, а воспринимают дополнительную окраску фуксином. Например: менингококки, гонококки, кишечная палочка, холерный вибрион и др.
Техника окраски
1. Препарат залить генцианвиолетом – 3-4 мин.
2. затем раствором люголя – 2 мин.
3. обесцветить спиртом – 15-20 сек.
4. Промыть водой.
5. докрасить фуксином водным 2-3 мин.
6. Смыть краску водой, препарат просушить фильтровальной бумагой.
Метод Бурри-Гинсаприменяется для обнаружения капсул.
Капсулы представляют собой наружный слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов или пептидов с содержанием большого количества воды, поэтому капсула не окрашивается анилиновыми красителями. Для выявления капсулы по методу Бурри-Гинса культуру бактерий смешивают на предметном стекле с тушью, мазок высушивают, фиксируют и докрашивают обычным фуксином. При этом на черном фоне капсулы видны светлыми ореолами вокруг розовых бактерий. Например: пневмококки, возбудитель чумы, сибирской язвы и др.
Техника приготовления препарата.
На предметное стекло наносят каплю культуры и каплю туши, смешивают их краем шлифованного предметного стекла и делают препарат по типу мазка крови, затем высушивают, фиксируют и докрашивают две минуты водным фуксином.
Метод Циля-Нильсенаприменяется для выявления бактерий и спор, обладающих кислотоустойчивостью. Кислотоустойчивые микроорганизмы не окрашиваются простыми методами, так как содержат в клеточной стенке до 40% жировосковых веществ и фосфолипидов. Поэтому препараты сначала протравливают кислотой (метод Ожешка) и окрашивают при подогревании краски основным карболовым фуксином Циля (метод Циля-Нильсена). Затем препарат обесцвечивают серной кислотой и докрашивают метиленовой синькой. При этом кислотоустойчивые бактерии и споры окрашиваются в красный цвет, некислотоустойчивые элементы и бактерии - в синий.
Техника окраски.
1. На фиксированный препарат нанести раствор основного фуксина через кусочек фильтровальной бумаги, подогреть краску до появления пара 3-5 мин.
2. Снять фильтровальную бумажку, нанести 3-5% раствор серной кислоты - 20-30 сек. и смыть водой.
3. Докрасить препарат водной метиленовой синькой – 3-5 мин.
тесты для рейтингового контроля (примеры).
1. Клеточная стенка у грамположительных бактерий имеет:
1. много слоев пептидогликана.
2. наружную плазматическую мембрану.
3. в основном полисахариды.
2. Грамположительные бактерии - это:
1. менингококки.
2. стрептококки
3. стафилококки
4. кишечная палочка.
5. микобактерии туберкулеза.
3. Для выявления капсулы применяют методы окраски:
1. по Граму.
2. по Цилю-Нильсену.
3. простую окраску фуксином.
4. метод Бурри-Гинса.
Самостоятельная лабораторная работа студентов.
1. Приготовление мазка из смеси E.Coli и Staphylococus albus.
Окраска по Граму. Записать процесс окраски грамположительных и грамотрицательных бактерий.
2. Определение подвижности E.Coli.
3. Просмотреть демонстрационные препараты:
а) споры В.anthraсoides, окрашенные по методу Циля-Нильсена
б) капсулы В.Friedlanderi, выявленные по Бурри-Гинсу
в) препарат Neisseriae gonorrhoeae грамотрицательный.
Г) препарат Corynebacterium diphtheriae грамположительный.
4. Зарисовать все препараты цветными карандашами, указать латинские названия микробов
5. Получить подпись преподавателя под протоколом.