Водный обмен растительной клетки.
Распределение воды в клеточных структурах. Содержание воды в растительных тканях представляет исключительно изменчивую и динамическую величину. Оно различно у разных видов растений, органах, претерпевает сезонные и суточные изменения, обуславливается возрастом ткани, доступностью почвенной влаги и соотношением поглощения воды и испарения.
Больше всего воды в растительной клетке концентрируется в вакуоли – до 98%. Содержание воды в цитоплазме может достигать 95% от ее массы. Оводненность органелл в среднем равна 50%. В ядре содержится 20 – 30% воды. вода является важным структурным компонентом мембран, которые могут содержать до 25% воды. содержание воды в клеточных стенках тургесцентных клеток может составлять более 50%. В клетках меристем, имеющих лишь малочисленные мелкие вакуоли и тонкие клеточные оболочки, основная масса воды заключена в цитоплазме.
Формы воды в клетке. Для функционирования живых организмов важны не только и даже не столько их общая Оводненность, сколько то состояние, в котором находится содержащаяся в них вода – ее концентрация (как всякое другое вещество, вода в гетерогенной среде обладает той или иной концентрацией), подвижность и т.д. Должно быть совершенно очевидным, что свойства внутриклеточной воды, в том числе структурные и физико-химические, изменены по сравнению с дистиллированной (чистой) водой, что в клетке существуют различные по своей подвижности и другим параметрам водные фракции. Иными словами наряду со свободной существует и связанная вода. Понятие о свободной и связанной воде заимствовано из физической химии. Свободная – это чистая, лишенная каких-либо примесей вода с высокой подвижностью. Под связанной понимают содержащуюся в гетерогенных системах воду, которая не может служить растворителем, имеет ограниченную подвижность, более плотную упаковку (то есть повышенную упорядоченность пространственной организации) молекул, пониженную температуру замерзания и повышенную температуру кипения.
До 1950 - 60-х годов физиологи уделяли большое внимание содержанию свободной и связанной воды в растениях, определяя его главным образом с помощью водоотнимающих средств (Гусев, 1960). Однако полученные данные были поставлены под сомнения по следующим двум причинам. Во-первых, появились физические методы – ядерный магнитный резонанс (ЯМР), диэлектрическая инфракрасная спектроскопия. Эти методы были разработаны применительно и сравнительно простым растворам. Однако их «с ходу» применяли к анализу сложнейших биологических систем и сразу же пришли к парадоксальному выводу сначала о том, что вся вода в растении связана и свободной воды вообще нет. Изменив настойку прибора, на тех же объектах они получили диаметрально противоположный результат – о полном отсутствии в клетке связанной воды. Во-вторых, оказалось, что на выход воды в гипертонические растворы из растительного материала влияет не только состояние воды в изучаемом объекте, но и водопроницаемость мембран. Установлено, что проницаемость мембран для воды составляет 10-4 см/с, то есть в 100 000 меньше скорости диффузии молекул воды через водный слой толщиной в 7 нм. Кроме того проницаемость мембран для воды в живых клетках меньше, чем в мертвых, которые контролируют ее поток. В настоящее время из трех применявшихся первоначально методов для работы с биологическими объектами остался метод ЯМР. Два других метода применяют в основном при изучении свойств воды только в растворах.
Различают три формы связанного состояния воды: осмотически связанную, коллоидно-связанную и капиллярно связанную. Осмотически связанная вода участвует в гидратации растворенных низкомолекулярных веществ (ионов и молекул). Коллоидно-связанная вода включает интромицеллярную воду, находящуюся внутри коллоидной системы (в том числе и иммобилизованную воду) и интермицеллярную воду на поверхности коллоидов и между ними. В коллоидах вода может связываться белками и полисахаридами. Даже при сильном обезвоживании растительного организма очень большие количества воды удерживаются внутри клеток гидратированными коллоидами, ионами и другими осмотически активными веществами. Капиллярно связанная вода находится в клеточных стенках и сосудах поводящей системы. Клеточные стенки удерживают воду за счет высокой гидрофильности пектиновых веществ и целлюлозных компонентов. Они содержат две фракции воды: подвижную и малоподвижную. Вода, удерживаемая в микрокапиллярах, а также связанная Н-связями с полисахаридами, малоподвижна. Свободная вода легче перемещается в крупных капиллярах между микрофибриллами целлюлозы. Передвижение воды вне проводящих пучков происходит, главным образом, по клеточным стенкам.
Состояние воды в разных частях клетки неодинаково. В цитоплазме находится в основном коллоидно-связанная вода, но имеется свободная и осмотически связанная. В клеточном соке преобладает осмотически связанная и свободная вода.
Физиологическое значение свободной и связанной воды различно. Скорость химических реакций, интенсивность физиологических процессов зависят от состояния и структуры воды и, в первую очередь, от содержания свободной воды. с другой стороны, имеется положительная корреляция между содержанием связанной воды и устойчивостью клеток к неблагоприятным условиям.
Метод ядерно-магнитного резонанса (ЯМР). Метод ЯМР используется для определения соединений, содержащих ядра с нечетным количеством протонов и нейтронов. Водород как раз входит в их число. Такие ядра обладают магнитным моментом, обусловленным их вращательным моментом (спином). При помещении в постоянное магнитное поле эти магнитные моменты поляризуются, располагаясь вдоль силовых линий. Если затем подействовать переменным полем, то при определенной частоте будет наблюдаться поглощение энергии переменного поля исследуемыми ядрами (резонансное поглощение). В результате ядерные спины переходят с более низкого энергетического уровня на более высокий. Это поглощение энергии ядрами регистрируется специальными спектрометрами ЯМР – получаются то более суженные, то более широкие полосы поглощения. В твердых телах, где атомы фиксированы, эти полосы частот поглощения широкие, а в жидкостях, из-за быстрых хаотических тепловых движений атомов, линия поглощения узка. Таким образом, ширина линии резонанса в спектре ЯМР находится в обратной зависимости от подвижности атомов и молекул. Изменение подвижности молекул воды также отражается на ширине линии резонанса: чем шире, тем менее подвижны молекулы воды (то есть она каким-то образом связана).
Для исследования состояния воды в биологических объектах применяют импульсный метод ЯМР – метод спинового эха. Импульсный метод предполагает кратковременное воздействие переменным полем. Метод позволяет с достаточной точностью определить время протонной релаксации (термодинамического равновесия системы), а также коэффициент самодиффузии, характеризующий интенсивность поступательного движения молекул воды.
Методом ЯМР можно оценить не только подвижность воды (количество свободной и связанной воды), но и наблюдать за изменением проницаемости клеточных мембран под влиянием различных факторов; оценить распределение внутриклеточных структур; определить количество незамерзающей воды; исследовать пути движения воды при межклеточном транспорте. Исследуя методом ЯМР высушенную биомассу некоторых микроорганизмов и низших растений, обнаружили (Аксёнов, 1979) оставшуюся в них воду с подвижностью, сниженной на один порядок (Д = 0,25 * 10-5 см2/с), и энергией активации такой же, как у чистой воды (Еа = 4.4 ккал/моль). Количество ее достигало 20 – 30% от веса высушенной биомассы. Эта вода сохранилась потому, что она была полностью окружена липидным слоем (в результате перестройки мембран при обезвоживании). Извлечение ее из клеток возможно лишь при воздействии внешней воды, восстанавливающей нормальную структуру мембран, или при разрушении мембран нагреванием до 150 – 2000 С. Эту воду С.И. Аксёнов назвал изолированной.
Осмотический механизм. Поглощение воды из внешней среды – обязательное условие существования живых организмов. Вода может поступать в клетки благодаря набуханию биоколлоидов, то есть увеличению степени их гидратации. Такое поступление оды характерно для сухих семян, помещенных в воду. Однако главным способом воды в живые клетки является ее осмотическое поглощение.
Осмосом (от греч. оsmos – давление, толчок) называется односторонняя диффузия молекул воды или другого растворителя в раствор через полупроницаемую мембрану, которая пропускает молекулы растворителя, но не растворенных веществ.
Первый осмометр был сконструирован в 1826 году французским физиологом Анри Дютроше. К кончику стеклянной трубки он привязал мешочек из пергамента, заполненный раствором соли или сахара, и опустил его в стакан с водой. При этом воды поступала в мешочек и раствор поднимался по трубке. Это была простейшая модель клетки, которую назвали осмометром Дютроше.
В 1877 году немецкий ботаник В. Пфеффер создал более совершенную модель растительной клетки. Роль клеточной стенки играл пористый фарфоровый сосуд. Полупроницаемую мембрану получили, налив внутрь фарфорового сосуда раствор медного купороса и погрузив этот сосуд в другой, с раствором ферроцианида калия. В результате в порах фарфорового сосуда возникла полупроницаемая мембрана из ферроцианида меди – Cu2[Fe(CN)6]. Затем сосуд наполнили раствором сахара, играющего роль клеточного сока, и поместили в сосуд с водой. Вода стала поступать в сосуд. То же самое наблюдается и в клетке если поместить ее в воду – вода поступает в вакуоль (рис. 4).
Рис.4. Осмометр Пфеффера и растительная клетка (из Э. Либберта, 1976)
Соединив свой прибор с трубкой, В. Пфеффер установил, что в результате поступления воды в фарфоровый сосуд с раствором сахара концентрация раствора уменьшается и движение воды замедляется. Поступление воды приводит к увеличению объема жидкости в осмометре и поднятию ее по трубке. Вода будет подниматься до тех пор пока давление водяного столба в ней не станет равным силе, с которой молекулы воды поступают в осмометр. В достигнутом состоянии равновесия полупроницаемая мембрана в единицу времени пропускает в обоих направлениях одинаковое количество воды. давление столба жидкости в трубке служит мерой осмотического давления раствора.
Осмотическое давление - это то дополнительное давление, которое необходимо приложить к раствору, чтобы препятствовать одностороннему току растворителя (воды) в раствор через полупроницаемую мембрану. В. Пфеффер измерил осмотическое давление нескольких растворов разной концентрации. Датский химик Я. Вант-Гофф обобщил его результаты и предложил уравнение для расчета осмотического давления (П): П = RTci, где R – газовая постоянная; Т – абсолютная температура; с - концентрация раствора в молях; i – изотонический коэффициент, равный 1 + 
(n - 1), где – степень диссоциации, n –число ионов, на которые распадается молекула электролита.
На величину осмотического давления влияет концентрация лишь растворенных в воде веществ. Такие вещества называются осмотически активными. Это – органические кислоты, аминокислоты, сахара, соли. Осмотическое давление выражается в атмосферах, барах или паскалях: 1 атм. = 1,013 бара = 105 Па. 103 Па – 1 кПа; 106 Па = 1 МПа. Растворы с одинаковым осмотическим давлением называются изотоническими. Между ними осмос не наблюдается. Раствор, имеющий большее осмотическое давление, называется гипертоническим, меньше – гипотоническим.
После работ Пфеффера поступление воды в клетку стали объяснять только разностью осмотического давления клеточного сока и наружного раствора. Если клетка находится в гипотоническом растворе или в воде, то вода входит в нее (эндоосмос); если клетка находится в гипертоническом растворе. То вода выходит из клетки (экзоосмос). В последнем случае вакуоль сжимается, протопласт отходит от клеточной стенки. Наблюдается плазмолиз.
В 1918 году А. Уршпрунг и Г. Блюм доказали, что поступление воды зависит не только от разности осмотического давления. Поступая в клетку вода давит на протоплазму, клеточная оболочка растягивается, отчего клетка переходит в напряженное состояние – тургор. Давление протоплазмы на оболочку клетки называется тургорным давлением. Из-за небольшой эластичности клеточная стенка начинает давить на протопласт – возникает тургорное натяжение. Тургорное натяжение равно по величине тургорному давлению, но противоположно по знаку.
Осмотическое поступление воды приводит к возникновению гидростатического (тургорного) давления. Разность между ними определяет поступление воды в клетку в каждый данный момент.