Векторы для клонирования больших фрагментов ДНК
Клонирование больших (50—100 т.п.н. и более) фрагментов ДНК — важная проблема, поскольку при этом, во-первых, существенно облегчается создание геномных библиотек, а, во-вторых, удается провести функциональный анализ полных больших генов или их комплексов. Действительно, многие гены эукариот состоят из нескольких сотен т.п.н., а своеобразным рекордсменом является ген дистрофина, чья транскрибируемая область превышает 2 млн.п.н. Поэтому в последнее десятилетие были предприняты усилия по конструированию емких векторов. Сначала проблема была решена для дрожжевых клеток созданием искусственных хромосом YAC. Затем такие векторы были созданы на базе ДНК плазмидных профагов Р1 (РАС — PI artificial chromosome) и N15 (NAC — N15 artificial chromosome), а также F-плазмиды (ВАС — bacterial artificial chromosome). Векторы рРАС и pNAC позволяют клонировать сверхкрупные, а рВАС — гигантские фрагменты ДНК. Уточним, что названия YAC, РАС, ВАС и т. д. применяют для рекДНК, а сами векторы обозначают pYAC, рРАС и рВАС.
Векторы pNAC — пока единственные линейные прокариотические векторы. При клонировании больших фрагментов ДНК линейные векторы обладают преимуществом перед кольцевыми векторами, так как эффективность образования рекДНК в этом случае выше. В то же время следует учитывать, что в процедурах выделения большие линейные молекулы ДНК более ломки, чем кольцевые. Отметим важную особенность репликонов, использованных для создания вышеупомянутых векторов: все они малокопийны. Это вызвано необходимостью обеспечить стабильность клонируемой ДНК. Известно, что с увеличением ее размера увеличивается вероятность ее структурных перестроек (делеции, вставки, инверсии). Вероятность повышается по мере увеличения числа копий рекДНК, поскольку все более сказывается эффект межмолекулярной рекомбинации.