Векторы для клонирования больших фрагментов ДНК

Клонирование больших (50—100 т.п.н. и более) фрагментов ДНК — важная проблема, поскольку при этом, во-первых, суще­ственно облегчается создание геномных библиотек, а, во-вторых, удается провести функциональный анализ полных больших генов или их комплексов. Действительно, многие гены эукариот состоят из нескольких сотен т.п.н., а своеобразным рекордсменом является ген дистрофина, чья транскрибируемая область превышает 2 млн.п.н. Поэтому в последнее десятилетие были предприняты усилия по конструированию емких векторов. Сначала проблема была ре­шена для дрожжевых клеток созданием искусственных хромосом YAC. Затем такие векторы были созданы на базе ДНК плазмидных профагов Р1 (РАС — PI artificial chromosome) и N15 (NAC — N15 artificial chromosome), а также F-плазмиды (ВАС — bacterial artificial chromosome). Векторы рРАС и pNAC позволяют клонировать сверхкрупные, а рВАС — гигантские фрагменты ДНК. Уточним, что названия YAC, РАС, ВАС и т. д. применя­ют для рекДНК, а сами векторы обозначают pYAC, рРАС и рВАС.

Векторы pNAC — пока единственные линейные прокариотические векторы. При клонировании больших фрагментов ДНК линейные векторы обладают преимуществом перед кольцевыми векторами, так как эффективность образования рекДНК в этом случае выше. В то же время следует учитывать, что в процедурах выделения большие линейные молекулы ДНК более ломки, чем кольцевые. Отметим важную особенность репликонов, использованных для создания вышеупомянутых векторов: все они малокопийны. Это вызвано необходимостью обеспечить стабильность клонируе­мой ДНК. Известно, что с увеличением ее размера увеличивается вероятность ее структурных перестроек (делеции, вставки, инвер­сии). Вероятность повышается по мере увеличения числа копий рекДНК, поскольку все более сказывается эффект межмолекуляр­ной рекомбинации.