Теоретические основы гель-фильтрации
Способность молекул анализируемого соединения проникать в растворитель, поглощенный частицами набухшего геля, зависит от степени пористости частиц геля и от размера молекул соединения. Распределение вещества на колонке, заполненной набухшим гелем, зависит от общего объема растворителя внутри и снаружи частиц геля.
Для данного вида геля распределение анализируемого вещества в растворителе внутри и снаружи частиц геля определяется коэффициентом распределения Кd, который зависит от размера молекул вещества: для крупных – Kd = 0 (их не будет в растворителе внутри частиц геля), для малых – Кd = 1 (беспрепятственно проникают внутрь), для средних – 0 < Кd < 1 (проникают лишь частично). Kd равно отношению масс веществ, находящихся в неподвижной (Ms) и подвижной (Mm) фазах:
Kd = Ms/Mm.
Нулевой объём Vo – объем, необходимый для элюирования соединения, которое не проникает в неподвижную фазу. Для его определения обычно через колонку пропускают вещество с исключительно высокой молекулярной массой – голубой декстран.
Объём выхода (т.е. объём элюата, собранного с момента внесения вещества на колонку до момента выхода его с колонки) Ve определяется объёмом растворителя между гранулами геля Vo (так называемым внешним объёмом), коэффициентом распределения и объёмом растворителя внутри частиц геля Vi. Таким образом,
Ve = Vo + Kd · Vi (1.1)
Внутренний объём Vi можно рассчитать, исходя из известного сухого веса геля а и величины поглощения воды W:
Vi= aW. (1.2)
Численное значение Ve для данного вещества варьирует в зависимости от размера колонки, в то время как Kd является величиной постоянной и от геометрии колонки не зависит.
Если два вещества имеют различающиеся молекулярные веса и разные Kd (обозначим их через Kd΄ и Kd΄΄), то разность объёмов выхода Vs будет определяться следующим уравнением:
Vs = Ve΄ ─ Ve΄΄ = (Vo + Kd΄Vi) – (Vo + Kd΄΄Vi),
Vs = (Kd΄ ─ Kd΄΄) Vi. (1.3)
Vs измеряют также как разность между Vt и Vo, где Vt – общий объем колонки.
Объём элюции зоны VR – объём элюента, вышедший из колонки к моменту появления её пика.
VR = Vo + KVo
VR = Vo + Vs = Vo + KdVi, откуда
Kd = (VR-Vo) / Vi (1.4)
В случае острого пика объём элюции измеряют до момента выхода из колонки его вершины. Если объём исходного препарата мал, то его можно не учитывать и отмеривать VR с момента начала внесения препарата на колонку. Если объёмом препарата пренебречь нельзя, то в качестве начального момента берут тот момент, когда половина препарата внесена на колонку (рисунок 2, а). При обессоливании, когда зоны вещества на выходе из колонки имеют протяженную “площадку”, VR следует измерять от начала внесения препарата на колонку до того момента, когда концентрация вещества на выходе колонки достигнет 50% от своего максимального значения (рисунок 2, б) [1].
Рисунок 2. Определение объёма элюции VR.
Таким образом, для полного разделения двух веществ необходимо, чтобы объём исследуемого образца не превышал Vs. Поскольку на практике условия разделения отличаются от идеальных, объём образца должен быть несколько меньше величины Vs; от соотношения между объемом образца и внутренним объёмом Vi зависит как точность разделения, так и степень разведения образца. Для расчёта оптимального объёма столбика геля пользуются уравнениями (1.1) и (1.2) [3].
Величина разрешения Rs – отношение “расстояния” между вершинами двух соседних пиков к ширине пика у его основания. Разрешение считается приемлемым, если Rs = 1. Если Rs оказалось заметно больше единицы, то можно попробовать существенно увеличить скорость элюции, например в 10 раз. Пики расширятся, препарат разбавится. Известно, что разрешение пропорционально квадратному корню из длины колонки L. Исходя из этого, чтобы улучшить разделение, мы можем уменьшить длину колонки [1].