Применение интерферонов.

Интерфероны используются для лечения болезней, вызываемых вирусами герпеса, бешенства, гепатитов, цитомегаловирусом, рассеянного склероза, а также для профилактики вирусных инфекций. Вдыхание аэрозоля интерферонов позволяет предупредить развитие острых респираторных заболеваний. Несколько курьезной проблемой является то, что интерфероны, сами могут вызывать у пациентов простудные симптомы (насморк, повышение температуры и т.д.). Проблема побочного действия стоит особенно остро при длительном терапевтическом применении интерферонов, необходимом для лечения злокачественных опухолей. Интерфероны оказывают лечебное воздействие на организм больных раком груди, кожи, гортани, легких, мозга, мочевого пузыря.

Интерфероны выпускают в качестве лекарственных препаратов в виде каплей в нос, мазей, или растворов для инъекций. Существуют натуральные интерфероны, полученные из лимфоцитов донорской крови, и искусственно синтезированные с применением генно-инженерных технологий (РЕКОМБИНАНТНЫЕ). В НАСТОЯЩЕЕ ВРЕМЯ выпускают коммерческие препараты – человеческий лейкоцитарный, лимфобластный (ВЕЛФЕРОН) и фибробластный (ФЕРОН), а также интерфероны, полученные генно-инженерными методами: рекомбинантные альфа-интерферон (Роферон, Реальдерон), бета-интерферон и гамма-интерферон (Гаммаферон).

4. ПОЛУЧЕНИЕ ИНТЕРФЕРОНОВ

Интерфероны были открыты в 1957 г. в Национальном инсти­туте медицинских исследований в Лондоне как факторы устойчи­вости к вирусной инфекции. Было установлено, что клетки жи­вотных, подвергнутые воздействию вируса, выделяют в среду фак­тор, способный придавать свежим клеткам устойчивость к вирус­ной инфекции: он как бы препятствовал (интерферировал) раз­множению вирусов в клетке и в силу этой способности был на­зван интерфероном.

Известны три группы интерферонов: а-интерфероны (а-И), образующиеся при воздействии вирусов на лейкоциты; Р-интер- фероны (Р-И), появляющиеся при воздействии вирусов на фибро- бласты; у-интерфероны, продуцируемые Т-лимфоцитами в ответ на воздействие бактериальными и вирусными антигенами или ан­тисыворотками против поверхностных детерминант лимфоцитов.

Все интерфероны (кроме а-И) гликопротеины; они представля­ют собой типичные глобулярные белки, причем на долю а-спи-ральных структур приходится от 40 до 75 %. В а-И обнаружены две дисульфидные связи. Интерфероны — низкомолекулярные белки из 146—166 аминокислотных остатков; видоспецифичны.

К числу наиболее хорошо исследованных интерферонов челове­ка следует отнести а-интерфероны; число генов, их кодирующих, примерно 20. у-Интерферон в отличие от гетерогенного класса а- интерферонов представлен всего одним индивидуальным белком, который кодируется одним геном. Менее ясна ситуация в отноше­нии Р-интерферонов. Выделен только один белок, соответствую­щий Р-интерферону человека, — интерферон р,; ему соответствует практически вся противовирусная активность, обнаруживаемая после индукции фибробластов. Не исключено, что в геноме суще­ствует ряд генов, кодирующих различные Р-интерфероны. Интер­фероны — это как бы первая линия обороны против инфекции.

Интерфероны широко используются для лечения различных тяжелых заболеваний — острого вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы и некоторых видов лимфом. Их применяют и для лечения меланом, ряда опухолей гортани, лег­ких и мозга.

С учетом видоспецифичности интерферонов, предназначенных для лечения, необходимы такие препараты, которые получены из клеток человека. Традиционно их извлекают из крови человека (из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, т. е. пример­но одну дозу для инъекции). Долгое время большая часть мирово­го производства интерферонов осуществлялась в Финляндии (Хель­синки), а позже — во Франции. С 1980 г. одна из японских компа­ний наладила производство лимфобластоидного интерферона из лимфобластоидных клеток. С этой целью культура данных клеток индуцировалась вирусом сендай, после чего интерферон выделя­ли с помощью хроматографических колонок, заполненных моноклональными антителами против получаемого интерферона. В Шве­ции лимфобласты выращивали в ферментерах объемом 2000 л; полученные интерфероны очищали с помощью моноклональных антител.

Из всех видов интерферонов для мирового производства наи­более пригоден (3-И. Фибробласты, получаемые из тканей плода, можно поддерживать в культуре клеток, что дает возможность массового производства. Метод получения 3-интерферона был разработан в Англии.

В целом вышеперечисленные методы получения интерферонов характеризуются низким выходом, высокой стоимостью и недо­статочной чистотой препарата. На современном этапе наиболее перспективный метод — биосинтез интерферонов с помощью гене­тически сконструированных микроорганизмов. Однако использова­ние генно-инженерных технологий для получения интерферонов человека сопряжено с рядом трудностей. Во-первых, в смеси мРНК, кодирующих различные белки, содержание кодирующих интерферон чрезвычайно мало — всего около 0,1%. Тем не менее кДНК, полученные обратным транскрибированием, были клониро­ваны в Е. coli, что явилось революционным событием в теорети­ческих и прикладных исследованиях интерферонов. Ген интерфе­рона был встроен в векторную ДНК, и к нему были присоедине­ны бактериальные регуляторные элементы, программирующие его транскрипцию и трансляцию в бактериальной клетке (рис. 5.15).

Установлено, что интерфероны синтезируются в клетке снача­ла в виде предшественников, содержащих на N-конце полипеп­тидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется, и в результате образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов, способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Поэтому для того чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, кото­рая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид.

Данная процедура осуществлялась следующим образом. Ген интерферона содержит три участка расщепления рестриктазой Sau ЗА1, из которых один находится рядом с сигнальной частью. Не­полное расщепление гена этим ферментом позволяет выделить фрагмент гена, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый интерферон, но без первого цистеина. Трип­лет ATG, кодирующий цистеин, отщепляется ферментом вместе с сигнальной частью. Для восстановления полинуклеотидной пос­ледовательности полного гена химически был синтезирован не­большой фрагмент ДНК, содержащий данный триплет, а также примыкающий к нему триплет ATG — точка инициации синтеза белка. Этот фрагмент присоединили к изолированной части зре­лого гена, и в результате был восстановлен полный ген зрелого интерферона. Реконструированный ген ввели в плазмиду таким образом, что с ним оказался рядом участок ДНК-промотор, обес­печивающий начало синтеза мРНК. Экстракты из Е. coli, содер­жащие такую плазмиду, обладали противовирусной активностью.

Синтезированный генно-инженерным способом интерферон был выделен, очищен, и его физико-химические свойства оказа­лись близкими свойствам интерферона, полученного из крови, доноров. Удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона на 1 л бактериальной суспензии, содержащей примерно 10 бактериальных клеток, что в 5000 раз превосходит то количество интерферона, которое можно извлечь из 1 л крови доноров. При использовании генно-инженерных технологий в раз­ных лабораториях были получены штаммы бактерий, продуцирую­щих различные интерфероны: а-, (3- и у-типов. Недостаток исполь­зования Е. coli для получения [3- и у-интерферонов — отсутствие В бактерии аппарата гликозилирования эукариотических белков, что приводит к синтезу негликозилированных молекул. И хотя роль гликозилирования неясна и негликозилированные р- и у-интерфероны практически полностью сохраняют противовирусную ак­тивность, эта особенность диктует осторожный подход к исполь­зованию генно-инженерных препаратов в медицинской практике.

В настоящее время гены интерферонов клонированы в дрожжи и клетки высших эукариот, способных осуществлять гликозилирование.

В 1981 г. в США впервые для синтеза лейкоцитарного интерферона человека были употреблены генетически сконструирован­ные клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Полученная эффективная экспрессия гена LeIF и замена бактерий клетками дрожжей позволили увеличить производство интерферона в 10 раз.

Большое количество исследований было посвящено химичес­кому синтезу гена, кодирующего ЛИЧ из 166 аминокислот. Соот­ветственно, данный ген из 514 н.п. оказался самым крупным ге­ном, синтезированным в 1982 г. группой английских ученых. В Рос­сии в 1984 г. был осуществлен полный синтез гена а-И размером.

примерно 600 н.п. (Институт биоорганической химии под руководством М. Н. Колосова).

Несмотря на успехи, достигнутые в области получения интерферонов с помощью генно-инженерных технологий и их применения для лечения различных вирусных заболеваний, в том числе? онкологических, предстоит еще решить многие вопросы. На cовременном этапе не все гены интерферонов идентифицированы обнаружены новые гены a_L; мало известно о генах фибробластного интерферона (кроме гена Pi); до конца не расшифрованы меха­низмы их биосинтеза и взаимодействия с другими веществами. Вы­яснение многих явлений, связанных с интерферонами, приведет; к созданию новых средств для лечения ряда тяжелых заболеваний.

Схема биологического действия интерферона представлена на рис. 5.16.

Механизм действия интерферона можно свести к следующим? основным этапам. Связываясь с клеточными рецепторами, интерфероны инициируют синтез двух ферментов: 2',5'-олигоаденилатсинтетазы и протеинкиназы за счет инициации транскрипции со­ответствующих генов. Оба фермента проявляют свою активность в присутствии двухцепочечных ДНК, являющихся продуктами реп­ликации многих вирусов или содержащихся в их вирионах. Фермент 2',5'-олигоаденилатсинтетаза катализирует синтез 2',5'-олиго-; аденилатов (из АТР), которые активируют клеточную рибонуклеазу I; протеинкиназа фосфорилирует (и тем самым активирует) фак­тор инициации трансляции IF₂. В результате этих событий ингибируются биосинтез белка и размножение вируса (деградация иРНК. и рРНК) в инфицированной клетке, что вызывает ее лизис. Веро­ятны и другие механизмы действия интерферонов, например, инактивация тРНК, нарушение процессов метилирования и др.