Иммунды ферментті анализ, ИФА

Зертгелетін материалдың құрамындағы микробтың антигенін немесе сарысуындағы антиденелерді анықтауға мүмкіндік беретін - бұл қатты фазалық иммунды ферментті анализ (қатты фазалық иммунды сорбентті анализ).

Тапсырма 3.

Микробтардың антигендерін ИФА бойынша анықтау

Ингредиенттері: полистиролды планшеттердің ойықтарына бекітілген белгілі антиденелер; құрамында микробтың антигені бар зерттелетін материал; зерттелетін микробтың антигеніне пероксидазамен (П_х) белгіленген специфихалық антиденелер; ортофенилендиамин (О_ф, бұл түссіз сұйық хромоген, бірақ пероксидазамен байланысса қоныр түсі пайда болады).

Полистиролды пробиркалардың қабырғасына белгілі антигенге қарсы антиденелерді (антидене қарсы антитенді) жабыстырады, зерттеуге арналған затты енгізеді, 30-40 мин 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

Техникасы, кезендері: 1. Белгілі антиденелер бекітілген полистиролды планшеттін ойықтарына микробтың антигені бар зерттелетін материал енгізіледі. 30-40 мин. 37°С инкубацияланады. Детергент қосылган арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

2. Пероксидазамен белгіленген антиденелер ойықтарға енгізіледі. 30-40 мин 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

3. Ортофенилендиамин қосылғаннан кейін планшеттер бөлменің қаранғы орында 20 мин. ұсталады. Қатты фазалы ИФА нәтижесі спектрофотометр Мультискан арқылы есептеледі.

Нәтижелері: зерттелетін материалдың құрамында микробтың антигендері болғанда олар ойықтардың түбіндегі антиденелермен байланысады. Пх белгіленген антигендерімен байланысады. At + Ag - Пх комплексі түзіледі. Ақырғы кезенде ойықтарға енгізілген Оф Пх-мен байланысып қоңыр түсті болады. Бұл нәтижелі реакция.

Егер зерттелетін материалда микробтың антигендері болмаса, онда буфермен шайғаннан кейін ойықтардың түбінде тек ғана белгілі антиденелер орналасады. Содан кейін енгізген Пх-мен белгіленген антиденелерде ойықтардан буфермен шайылып кетеді. Реакцияның аяғында Оф түссіз боп қалады. Бүл нәтижесіз реакция.

б) Спецификалық антиденелерді анықтау

Ингредиенттер: полистиролды планшеттердің ойықтарына бекітілген белгілі микробты антигендер; зерттелетін сарысу; пероксидазамен бекітілген белгілі микробты глобулинге қарсы сарысу; ортофенилендиамин.

ИФА қою техникасы, кезендері: 1. Белгілі микробтың антигендері бекітілген полистиролды планшеттің ойықтарына зерттелетін сарысу еңгізіледі. 30-40 мин. 37°С инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімен ойықтар шайылады.

Пероксидазамен белгіленген АГС ойықтарға енгізіледі. 37°С 30-40 мин. инкубацияланады. Детергент қосылған арнайы буферлы ертіндімеи ойықтар шайылады.

3. Ортофенилендиамин қосылғаннан кейін планшеттер бөлменің қараңғы орында 20 мин. ұсталады.

4. Қатты фазалы ИФА нөтижесі спектрофотометр Мультискан арқылы есептеледі

Нөтижелері: зерттелетін сарысудын құрамында антиденелер болғанда ойықтардың түбіндегі антигендермен байланысады және буферлы ертіндімен шайылып кетпейді. Содан кейін енгізілген АГС - Пх ойықтардың түбінде қалады. Ag + At + АГС - Пх комплексі түзіледі. Енгізілген Оф Пх-мен байланысып қоңыр түсті болады. Бұл нәтижелі реакция.

Егер зерттелетін сарысудың құрамында антиденелер болмаса, онда ойықтардың түбінде тек ғана алдын ала бекітілген микробтың антигені қалады. Содан кейін енгізілген АГС - Пх буферлы ертіндімен шайылып кетеді, ал Оф түссіз боп қалады. Бүл нәтижесіз реакция.