Гетеротрофные бактерии (протеолитические, липолитические, гликолитические)

Гетеротрофные бактерии представляют собой микроорганизмы, использующие в качестве источника энергии и углерода органические, т. е. углеродсодержащие соединения. Среди гетеротрофных бактерий встречаются как аэробы, так и анаэробы. Многие виды данных микроорганизмов утилизируют сахара, спирты и органические кислоты. Однако существуют специализированные гетеротрофные бактерии, способные разлагать также целлюлозу, лигнин, хитин, кератин, углеводороды, фенол и др. вещества. Гетеротрофные бактеири широко распространены в почве, воде и грунте водоёмов, пищевых продуктах и т.д. Они также принимают активное участие в круговороте веществ в природе [7].

1.2.2.1 Протеолитические бактерии

Протеолитические бактерии – очень большая группа анаэробов, получающая энергию за счет анаэробного разрушения аминокислот. Многие из них являются строго протеолитическими организмами, неспособными сбраживать углеводы. Другие обладают слабовыраженной сахаролитической активностью. Имеются также активные протеолитические виды, способные осуществлять маслянокислое брожение сахаров. Протеолитическая активность у некоторых анаэробов (CI. histolyticum) настолько высока, что у зараженных этими микроорганизмами животных наблюдается как бы расплавление мышц, после чего остаются голые кости. Освобождающиеся после протеолиза (разрушение белков протеолитическими ферментами) аминокислоты могут сбраживаться двумя путями. К примеру, CI. sporogenes сбраживает пару аминокислот, причем одна из них окисляется, а другая восстанавливается (реакция Стикленда), т. е. одна аминокислота служит донором, а другая – акцептором водорода. Это происодит по следующей реакции: аланин + 2глицин + Н₂О → 3уксусная кислота+СО₂+NH ₃

Существуют виды протеолитических анаэробов, которые могут сбраживать и по одной аминокислоте, например глутаминовую кислоту (CI. tetani).

К протеолитическим относятся клостридии, имеющие активные протеолитические ферменты и поэтому способные использовать в качестве субстратов белки и пептиды, гидролизуя их до аминокислот и подвергая затем последние сбраживанию. В эту группу входят Сlostridium putrifitcum, Сlostridium histolyticum, Сlostridium sporogenes и другие сапрофитные виды. Близки к этим видам и некоторые патогенные формы: Сlostridium botulinum – продуцент ботулина – экзотоксина, являющегося одним из самых сильных биологических ядов; Сlostridium tetani –столбнячная палочка, образующая в организме человека столбнячный токсин.

К протеолитическим клостридиям примыкают виды, использующие в качестве источника углерода и энергии ограниченное число свободных аминокислот. Например, Сlostridium cochlearium растет только на среде с глутаминовой кислотой, глутамином и гистидином; Сlostridium sticklandii может сбраживать лизин, аргинин, фенилаланин, серии, а Сlostridium propionicum – треонин, аланин, серии, цистеин.

Известны два типа сбраживания аминокислот клостридиями. Для многих клостридиев одна аминокислота может служить источником энергии и углерода, например, глутаминовая кислота – для Сlostridium tetanomorphum , лизин – для Сlostridium sticklandii . В этом случае ее диссимиляция приводит к возникновению метаболитов, характерных для гликолитического пути, и в первую очередь пирувата. У Сlostridium sticklandii сбраживание лизина приводит к образованию масляной и уксусной кислот и NH₃, а у Сlostridium tetanomorphum при сбраживании глутаминовой кислоты в дополнение к перечисленным выше продуктам образуется некоторое количество СО₂.

Ряд аминокислот может подвергаться сбраживанию клостридиями только парами. Механизм процесса был расшифрован Л.Стиклендом в 1934 г., показавшим, что при этом происходит сопряженное окисление – восстановление пары аминокислот, одна из которых окисляется, другая – восстанавливается. Такой тип сбраживания аминокислот получил название реакции Стикленда . Окисляемыми аминокислотами, т.е. донорами электронов, служат аспарагин, аланин, валин, серин, гистидин и др. Восстанавливаемые аминокислоты – глицин, пролин, орнитин, аргинин и др [6].

1.2.2.2 Липолитические бактерии

Липиды подвергаются гидролитическому разложению под действием липаз. Одним из примеров продуцентов липаз являются бактерии рода Clostridium и другие микроорганизмы. Для выявления липолитической активности исследуемые микроорганизмы высевают на среду, содержащую соответствующий липид. Определенная трудность при постановке таких опытов связана с тем, что жиры не смешиваются с водой. Поэтому чаще всего вместо жиров в среду вводят твины – эфиры жирных кислот и сорбита. Твин-40 содержит пальмитиновую, твин-60 – стеариновую, а твин-80 – олеиновую кислоты. Твины хорошо растворимы в воде и имеют нейтральную реакцию. Состав среды (г/л): твин – 10,0; пептон – 10,0; NaCl – 5,0; СаС12Н20 – 0,1; агар – 20,0; рН среды 7,4. Готовят среду без твина и стерилизуют ее при давлении 1 атм. Водный раствор твина соответствующей концентрации стерилизуют отдельно при 0,5 атм и добавляют к стерильной основной среде. Среду разливают в чашки Петри. Когда агар застывает, на поверхность агаровой пластинки высевают штрихом или уколом исследуемый микроорганизм. Засеянные чашки Петри выдерживают при соответствующей температуре необходимое для роста микроорганизма время. На наличие липазы указывает образование вокруг штриха или колонии непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот, освобожденных из твина [8].

Липолитические бактерии являются деструкторами защитных покрытий, приводя к разрушению молекул пластификаторов и стабилизаторов, ациклические и ароматические углеводороды, низкомолекулярные фракции покрытий, а также другие компоненты, входящие в их состав.

При изучении биостойкости нефтебитумных покрытий в агрессивных грунтах методом инфракрасной спектроскопии было установлено, что под действием бактерий происходит разрушение связей С=О и S=O, которое может привести к обрыву олигомерных цепей и, как следствие, к уменьшению прочности покрытий. Можно полагать, что такие изменения в химическом составе покрытий являются результатом действия гидролитических ферментов бактерий, в частности липазы, которая может разрушать сложные эфирные связи углеводородов, входящих в состав изоляционных материалов.

При изучении влияния различных доз нефти и нефтепродуктов на активность липазы серой лесной почвы, было установлено, что углеводороды активизируют липолитическую активность почвы. Параллельно с активацией липолиза наблюдалось увеличение численности углеводородокисляющих бактерий. В нефтезагрязненных почвах присутствует значительное количество битумов, которые являются одним из стимуляторов активности липаз в почве. Некоторые исследователи предлагают использовать активность липазы в качестве одного из показателей биодеструкции нефти и нефтепродуктов [9].

1.2.2.3 Гликолитические бактерии

Ферментативное расщепление и окисление глюкозы называют гликолизом (греч. glycos – сладкий, lysis – расщепление). Ферменты, окисляющие глюкозу, составляют своего рода ферментативный "конвейер". Гликолиз происходит в цитоплазме. При этом одна шестиуглеродная молекула глюкозы С₆Н₁₂О₆ ступенчато расщепляется и окисляется при участии ферментов до двух трехуглеродных молекул пировиноградной кислоты в этом превращении глюкозы последовательно участвуют девять ферментов. Если сравнить число атомов в двух молекулах пировиноградной кислоты СН₃СОСООН и в молекуле глюкозы С₆Н₁₂0₆, то станет ясно, что в процессе гликолиза молекула глюкозы не только расщепляется на две трехуглеродные молекулы, но и теряет четыре атома водорода, т. е. происходит ее окисление. Акцептором водорода (и электронов) в этих реакциях служат молекулы никотинамидадениндинуклеотида ( НАД ), которые похожи по структуре на НАДФ и отличаются только отсутствием остатка фосфорной кислоты при молекуле рибозы. В процессе аэробного гликолиза происходит восстановление окисленного НАД⁺ в НАДН. За счет энергии окисления глюкозы до пировиноградной кислоты фосфорилируются также четыре молекулы АДФ в АТФ. Что касается молекул НАДН, то запасенная ими энергия используется далее для получения АТФ.

На этапе окисления глюкозы кислород еще не участвует непосредственно, однако присутствие его в клетке обеспечивает дальнейшее окисление пировиноградной кислоты.

Последовательность биохимических реакций, лежащих в основе гомоферментативного молочнокислого брожения, получила название фруктозодифосфатного пути, или пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса.

Данный путь доминирует у большинства аэробных и анаэробных бактерий. Характерная реакция гликолиза – расщепление фруктозо-1,6-дифосфата альдолазой, в результате чего образуется смесь триозофосфатов, состоящая из дигидрооксиацетонфосфата и глицероальдегидтрифосфата, которые затем превращаются в пируват (рисунок 1). Фермент обратной связи, лимитирующий скорость процесса, – фруктозо-6-фосфат дегидрогеназа (фосфофруктокиназа). В этом процессе образуется 2 моля АТФ и 2 моля восстановленного НАД (НАДН⁺) на 1 моль глюкозы.

 

Рисунок 1 – Гликолитический путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса

Гомоферментативное молочнокислое брожение, в основе которого лежит гликолитический путь разложения глюкозы, является единственным способом получения энергии для группы эубактерий , которые при сбраживании углеводов превращают в молочную кислоту от 85 до 90% сахара среды. Бактерии, входящие в данную группу, морфологически различны. Это кокки, относящиеся к родам Streptococcus и Pediococcus, а также длинные или короткие палочки из рода Lactobacillus . Последний подразделяется на три подрода. Бактерии, включенные в два из них ( Thermobacterium, Streptobacterium ), также осуществляют гомоферментативное молочнокислое брожение. Все бактерии этой группы положительно окрашиваются по Граму, не образуют спор, неподвижны. Группа весьма гетерогенна в отношении нуклеотидного состава ДНК: молярное содержание ГЦ-пар оснований колеблется от 32 до 51 %. Значительные колебания по этому признаку характерны и для бактерий, объединенных в роды и даже подроды.

Лактатдегидрогеназа, катализирующая превращение пирувата в лактат , стереоспецифична. У разных видов она содержится в виде определенных оптических изомеров; в зависимости от этого бактерии продуцируют D- или L-форму молочной кислоты. Те из них, которые образуют смесь D- и L-форм, содержат или две формы фермента, различающиеся стереоспецифичностью, или лактатрацемазу.

У этой группы эубактерий молекулярный кислород не включается в энергетический метаболизм, но они способны расти в присутствии О₂, т.е. являются аэротолерантными анаэробами. (Некоторые авторы представителей рода Lactobacillus относят к микроаэрофилам ). В их клетках в значительном количестве содержатся флавиновые ферменты, с помощью которых происходит восстановление молекулярного кислорода до Н₂О₂. Из-за неспособности молочнокислых бактерий синтезировать гемовую группу у них отсутствует каталаза – фермент, катализирующий разложение перекиси водорода, поэтому последняя может накапливаться в клетке.

Особенностями конструктивного метаболизма гомоферментативных молочнокислых бактерий являются слабо развитые биосинтетические способности, что выражается в большой зависимости их роста от наличия в питательной среде готовых органических веществ (аминокислоты, витамины группы В, пурины, пиримидины). В качестве источника углерода молочнокислые бактерии используют лактозу (молочный сахар) или мальтозу (растительный сахар, образующийся при гидролизе крахмала). Они могут также использовать некоторые пентозы, сахароспирты и органические кислоты.

Из всех известных непатогенных прокариот молочнокислые бактерии отличаются наибольшей требовательностью к субстрату. Зависимость этих бактерий от наличия готовых органических веществ среды указывает на примитивность в целом их конструктивного метаболизма.

Молочнокислые бактерии распространены там, где они могут обеспечить свои высокие потребности в питательных веществах и где имеются большие количества углеводов, переработка которых дает им необходимую для роста энергию. Их много в молоке и молочных продуктах, на поверхности растений и в местах разложения растительных остатков; обнаружены они в пищеварительном тракте и на слизистых оболочках животных и человека.

Скисание сливок, необходимое для получения сливочного масла, также вызывают бактерии рода Streptococcus. Помимо молочной кислоты некоторые из них образуют ацетоин и диацетил, придающие сливочному маслу характерный запах и вкус. Субстратом служит лимонная кислота, содержание которой в молоке может достигать 1 г/л. Реакции, ведущие к образованию этих веществ, начинаются с расщепления лимонной кислоты, которая впоследствии переходит в уксусную и щавелевоуксусную кислоты.

Уксусная кислота выделяется в среду, а щавелевоуксусная кислота (ЩУК) декарбоксилируется, что приводит к образованию пирувата.

Дальнейшее метаболизирование пирувата осуществляется по трем различным путям: часть молекул восстанавливается до молочной кислоты; другая часть подвергается декарбоксилированию, приводящему к возникновению разных С₂-интермедиатов ( ацетил-КоA и "активный" ацетальдегид) и взаимодействию между ними, заканчивающемуся синтезом молекулы диацетила.

Ферменты гликолитического пути обнаружены также в разных условиях роста в клетках С. Aurantiacus.

С. aurantiacus может быть охарактеризован как факультативный анаэроб и фототроф. На свету он растет в аэробных и анаэробных условиях в присутствии разнообразных органических соединений: сахаров, спиртов, органических кислот и аминокислот. Некоторые штаммы этого вида способны к анаэробному фотоавтотрофному росту, используя Н₂ или H₂S в качестве донора электронов. Окисление H₂S приводит к образованию молекулярной серы и отложению ее в среде в виде аморфной массы. Молекулярная сера в очень незначительной степени затем окисляется до сульфата. Хемогетеротрофный рост также возможен в аэробных и для отдельных штаммов в анаэробных условиях.

Гликолитическое брожение может протекать также под действием бактерий, относящихся к роду Clostridium, осуществляющих сбраживание углеводов по гликолитическому пути с накоплением масляной кислоты в качестве одного из основных продуктов.

Гликолитическое расщепление глюкозы с образованием в качестве обязательного промежуточного соединения пировиноградной кислоты является основным путем разложения глюкозы для пропионовокислых бактерий. В эту группу, объединяемую в род Propionibacterium, входят грамположительные, неподвижные, не образующие спор палочковидные бактерии, размножающиеся бинарным делением. В зависимости от условий культивирования и цикла развития форма клетки может меняться до кокковидной, изогнутой или булавовидной. Типовой вид – Propionibacterium freudenreichii .

Большинство пропионовокислых бактерий – аэротолерантные анаэробы, получающие энергию в процессе брожения , основным продуктом которого является пропионовая кислота. Аэротолерантность их обусловлена наличием полностью сформированной ферментной системы защиты от токсических форм кислорода (супероксидный анион, перекись водорода). У пропионовокислых бактерий обнаружены супероксиддисмутазная, каталазная и пероксидазная активности. Внутри группы отношение к О₂ различно. Некоторые виды могут расти в аэробных условиях.

Гликолитический путь катаболизма органических соединений отмечен также у несерных пурпурных бактерий. Пурпурные несерные бактерии имеют склонность к фотоорганогетеротрофному образу жизни, предпочитая в качестве доноров электронов и источников углерода в процессе фотосинтеза простые органические соединения: жирные кислоты, спирты, сахара, аминокислоты. Многие виды способны расти фотолитоавтотрофно, используя молекулярный водород в качестве донора электронов для восстановления СО₂.

Некоторые типичные несерные пурпурные бактерии растут при освещении на минеральной среде, используя в качестве донора электронов H₂S, тиосульфат или молекулярную серу. В большинстве случаев сульфид окисляется только до молекулярной серы, никогда не откладывающейся в клетке, но в отдельных случаях возможно последующее окисление моноксида серы до сульфата.

Для некоторых клостридиев (Сlostridium aceticum, Сlostridium thermaceticum, Сlostridium formicaceticum и др.) характерно сбраживание сахаров, приводящее практически к образованию только одного конечного продукта – уксусной кислоты (гомоацетатное брожение); из 1 молекулы сброженной гексозы синтезируется 3 молекулы ацетата. Изучение последовательности биохимических реакций, приводящих к этому, показало, что сбраживание 1 молекулы гексозы по гликолитическому пути приводит к образованию только 2 молекул ацетата. Одновременно образуются и 2 молекулы СО₂. Третья молекула ацетата синтезируется из 2 молекул СО₂ принципиально иным путем. Фиксация углекислоты у гомоацетатных клостридиев происходит по нециклическому механизму, получившему название ацетил-КоA-пути , поскольку его ключевым метаболитом является ацетил-КоA. Виды, осуществляющие гомоацетатное брожение, называют также ацетогенными.

Активность ферментов гликолиза обнаружена у разных представителей тионовых бактерий. Что касается цианобактерий, то у некоторых видов найдены все ферменты, необходимые для сбраживания глюкозы до молочной кислоты, однако образование последней, а также активности гликолитических ферментов низки [10].