ФИТОПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ. МЕТОДЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕКАРСТВ

Микрофлора растительного лекарственного сырья. Обсемененность микробами растений, в том числе и лекарственных, может быть очень высокой и зависит от условий их произрастания, от характера растения, высоты стебля и других причин. Микрофлора растений (особенно срезанных и сорванных) и, соответственно, растительного лекарственного сырья, чрезвычайно разнообразна и представлена сапрофитными спорообразующими бактериями, актиномицетами и грибами, попадающими на растения с почвой. Среди микроорганизмов, встречающихся на растениях и в растительном лекарственном сырье, могут встречаться фитопатогенные виды (Erwinia herbicola, P. fluorescens, бактерии родов Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Corynebacterium, Agrobacterium, актиномицеты, некоторые грибы и др.), вызывающие заболевания растений. На растениях могут находиться также патогенные для человека микроорганизмы, в частности, бактерии родов Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella и пр., способные вызывать инфекционные заболевания у людей. Некоторые виды микроорганизмов, находящихся в растительном лекарственном сырье, обладают сильной ферментативной активностью, разрушая фармакологически активные вещества и снижая ценность лекарственного препарата.

Растительное лекарственное сырье может загрязняться микроорганизмами на всех этапах заготовки и хранения: сбора, пер­вичной обработки, сушки, измельчения, упаковки, а также в процессе получения резаного сырья, растительных порошков, брикетов, гранул, таблеток.

Консервирование и условия его хранения оказывают существенное влияние на его обсемененность. Хранение лекарственного сырья в условиях повышенной влажности способствует сохранению и даже размножению микроорганизмов, что сопровождается его порчей с изменением цвета, запаха, внешнего вида и появлением токсичных продуктов.

Загрязняя лекарственные препараты и исходное сырье, микроорганизмы могут изменять свойства лекарств, делая их неактивными или даже токсичными, благодаря ферментным превращениям лекарственного вещества или образованию микробных токсинов и пирогенов. Патогенные микроорганизмы могут вызывать инфекционные заболевания у людей, использующих пре­параты, загрязненные микроорганизмами родов Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella и др.

Лекарственное растительное сырье, которое используется для приготовления настоев, отваров и подвергается кипячению или обработке кипящей водой перед применением не должно содержать более 10⁷ бактерий в 1 г, не более 10⁵ грибов и не более 10² кишечных палочек.

Оценка микробной загрязненности растительного лекарственного сырья.Взвешивают 1 г сырья в асептических условиях, помещают его в в стерильную про­бирку с 5 мл изотонического раствора хлорида натрия , встряхивают на шуттель-аппарате в течение 10 мин., готовят разведения 1:10 и 1:100, делают посев 1 мл каждого разведения в глубину питательной среды в чашках Петри (по 2-3 чашки со средами Сабуро и МПА для выявления грибов и бактерий с выращиванием при температуре 24⁰ С и 37⁰ С соответственно). Подсчитывают количество выросших колоний и с учетом разведения определяют микробную загрязненность в 1 г сырья.

Микрофлора экстемпоральных (приготовленных в аптеке) и готовых лекарственных форм, изготовленных на фармацевтических заводах и фабриках. Лекарственные препараты, изготовляемые на фарма­цевтических заводах и в аптеках, в различной степени обсеменены различными микроорганизмами. Количество и качественный состав микробов в лекарствах варьирует в зависимости от обсеменности сырья, формы препарата, особенностей изготовления, санитарного состояния аптечного учреждения. Готовые лекарственные средства могут загрязняться обсемененными микробами дистиллированной водой, воздухом, посудой, пробками, оборудованием, упаковочным материалом, руками работников фармацевтических предприятий и аптек. Среди готовых лекарственных форм наиболее обсемененными являются препараты растительного происхождения - настои и отвары, жидкие и мягкие лекарственные формы, микробная порча которых наступает очень быстро, особенно при хранении их в теплом месте, сопровождаясь помутнением, появлением пленки и неприятного запаха, изменением цвета. Бактерии обнаруживаются в растворах солей, а из порошкообразных препаратов легко обсеменяются тальк, крахмал, сахар, зубной порошок.

Микрофлора лекарственных форм, изготовленных в аптеках, зависит от вида сырья, химической природы веществ, входящих в его состав, технологии приготовления, санитарно-гигенического состояния аптечных помещений, условий хранения лекарств.

При изготовлении лекарственных препаратов следует учитывать источники и пути их загрязнения и создавать условия, исключающие возможность микробного загрязнения. Для предупреждения микробного загрязнения лекарственных средств необходимо использовать доброкачественное сырье, изготовливая лекарства в асептических условиях, следует пользуясь стерильной посудой, соблюдать стерильность при укупорке лекарственных средств, правильно хранить их, неукоснительно соблюдать требования санитарно-гигиенического режима и личной гигиены, при необходимости пользоваться консервантами лекарственных форм.

В ряде случаев наличие микроорганизмов в лекарственных средствах удается определить только при микробиологическом анализе. Микробную загрязненность препаратов выражают количеством клеток микроорганизмов в 1 г сухого препарата или в 1 мл раствора. При микробиологическом исследовании готовых лекарственных форм следует принимать во внимание чувствительность или устойчивость микроорганизмов к лекарственному препарату, а также возможность антимикробного действия лекарства (бактериостатический и бактерицидный эффекты).

Для определения микробной загрязненности лекарственные неинъекционные средства подвергаются бактериологическому исследованию с целью определения в них количества сапрофитных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, а также наличия бактерий родов Proteus, Escherichia, Salmonella, Shigella, видов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Разработаны нормативные требования оценки микробной загрязненности неинъекционных препаратов. Нестерильные лекарственные формы для приема per os не должны содержать патогенной и условно-патогенной микрофлоры (энтеробактерий, золотистого стафилококка, синегнойной палочки). Лекарственные формы для местного, интравагинального применения, для применения в полости уха, носа не должны содержать более 100 микробных клеток в 1 г (мл) препарата. Для других лекарственных форм число сапрофитов не должно превышать 1000 клеток, а патогенных грибов - 100 клеток в 1 г препарата.

В лекарственных формах для приема внутрь (таблетки, драже, гранулы, капсулы, жидкие лекарственные формы), препаратах для ректального введения, ферментных препаратах не должно быть более 10³ бактерий и более 10² грибов в 1 г (мл). Лекарственные средства для детей в возрасте до 1 года не должны содержать более 50 клеток бактерий и грибов; для детей старше одного года — не более 5-10² бактерий и 50 грибов в 1 г (мл). Если нестерильное лекарственное средство для приема внутрь готовят из природного сырья (растительного, животного и пр.), которое не может быть подвергнуто антимикробной обработке, общее количество бакте­рий не должно превышать 10⁴, грибов (плесневых и дрожжевых суммарно) — не более 10², энтеробактерий - не более 10² ; препарат не должен содержать кишечных палочек, сальмонелл, золотистого стафилококка, синегнойной палочки.

Ряд лекарственных препаратов (антибиотики, сульфаниламиды, производные хиноксалина, 8-оксихинолина, нафтиридина, нитрофурана и другие) обладают выраженным антимикробным действием. Кислоты, щелочи, спирты, галогены, окислители, соли тяжелых металлов, красители, детергенты, дегти, смолы, серосодержащие вещества, фитонциды и др, используемые в качестве лекарственных средств, оказывают выраженное ингибирующее действие на рост и размножение микроорганизмов. Поэтому для правильной трактовки результатов определения микробной загрязненности лекарственного сырья и готовых лекарственных форм необходимо предварительно определить их антимикробные свойства. С этой целью тест-культуры микроорганизмов высевают на соответствующие питательные среды и вносят исследуемый препарат. Если по сравнению с контрольным просевом наблюдают подавление роста тест-культуры микроорганизма, делают заключение о наличии антимикробного действия препарата.

Определение антимикробного действия лекарственного средства. В качестве тест-штаммов используют следующие стандартные культуры из американской типовой коллекции культур (АТСС -American Type Culture Collection):

• Bacillus subtilis ATCC 6633;

• Escherichia coli ATCC 25922;

• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027;

• Staphylococcus aureus ATCC 6538-P;

• Candida albicans ATCC 885—653.

Культуры S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, B. subtilis (B. cereus) выращивают на глюкозном МПБ при температуре 37⁰ С в те­чение 18-20 ч; культуру гриба С. albicans - на жидкой среде Сабуро при температуре 24⁰ С в течение 48 ч.

Затем в пробирки с 4 мл плотных питательных сред для выращивания В. cereus и С. albicans, расплавлен­ных и охлажденных до 45—50⁰ С (по 4 пробирки с каждой средой), вносят по 0,1 мл бульонной культуры тест-организма, разведенной 1:1000. В половину пробирок с каждой средой, являющихся контрольными, добавляют по 1 мл стерильного фосфатного буфера рН 7,0. В другую половину пробирок вносят по 1 г (мл) препарата, разведенного 1:10 тем же буфером. Содержимое пробирок перемешивают и выливают в чашку Петри, содержащую 15—20 мл той же плотной питательной среды. Верхний слой агара равномерно распределяют по поверхности плотной среды, дают ему застыть, инкубируют при 37⁰ С в течение 5 суток.

Тест-культуры Е. coli, P. aeruginosa, S. aureus выращивают в пробирках с 10 мл сред накопления (по 4 пробирки с каждой средой), вносят по 0,1 мл суточной бульонной тест-культуры в разведении 1:1000. В одну половину пробирок вносят по 1 мл стерильной воды, в другую половину — по 1 г (мл) исследуемого препарата. Исследование проводят с применением дифференциально-диагностических сред (см. ниже).

В случае роста тест-штаммов на соответствующих питательных средах при добавлении испытуемого лекарственного средства делают заключение, что лекарственный препарат не обладает антимикробным действием. При последующем определении микробиологической чистоты используют вышеописанную методику прямого посева. Лекарственные средства исследуют в разведении 1:10.

Если рост тест-штаммов на питательных средах в присутствии лекарственного средства отсутствует, оно обладает антимикробным действием, которое устраняют добавлением специфического инактиватора, увеличением разведения препарата, применением неспецифических инактиваторов (твин-80, лецитин и др.), фильтрацией через мембранные фильтры.

Для инактивации пенициллинов и цефалоспоринов в буферный раствор и питательные среды вносят пенициллиназу (1000 ЕД на 1 мл среды для пенициллинов и 50 000—100 000 ЕД на 1 мл среды для цефалоспоринов), тетрациклинов - 10% сульфата магния. Сульфаниламидные препараты инактивируют внесением в среды парааминобензойной кислоты (0,05 г на 1 л среды). Для инактивации консервантов, входящих в состав мягких лекарственных средств, а также при изготовлении растворов и питательных сред, применяют неспецифические инактиваторы (3% твин-80, или 0,2% лецитин). При наличии в препарате более двух консервантов различной химической структуры используют смесь из 0,3% лецитина, 3% твина-80, 0,1% гистидина и 0,5% тиосульфата натрия. Если указанные методы неэффективны, применяют метод мембранной фильтрации.

Определение микробиологической чистоты лекарственного сырья и готовых лекарственных средств, не обладающих антимикробными свойствами.В лекарственных препаратах, не обладающих антимикробным действием, определяют общее количество бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, а также наличие бактерий семейства Enterobacteriaceae, видов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.

Из каждой серии препарата отбирают пробу не менее чем 50 г или 50 мл из 10 равных проб, взятых не менее чем из 10 разных упаковок. При анализе препарата используют 30 г образца, разделенного на 3 части по 10 г. Затем 10 г или 10 мл препарата с соблюдением стерильности разводят 0,1 М фосфатным буфером рН 7,0 или соответствующей питательной средой с конечным объемом до 100 мл. Труднорастворимые твердые лекарственные формы(порошки, таблетки, драже и др.) измельчают, после чего суспендируют в буферном растворе. При исследовании мягких лекарственных форм (мази, пасты, свечи, масла, эмульсии) готовят эмульсию препарата, для чего 10 г препарата, 10 г твина-80 и 80 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0, нагретых до 40—45⁰ С, вносят в колбу со стеклянными бусами (разведение 1:10),которую встряхивают 5 мин на водяной бане при 40—45^0- С дополучения гомогенной эмульсии.

Для посевов используют МПА с 0,1% глюкозы, агар Сабуро с антибиотиками (100 мг бензилпенициллина или 50 мг левомицетина на 1000 мл среды), среды обогащения для бактерий семейства Enterobacteriaceae, агар Эндо, висмут-сульфитный агар, среда с феноловым красным для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae, среда с нитратом калия, среда обогащения для S. aureus и P. aeruginosa, среда для выявления пигмента P. aeruginosa, солевой агар с маннитом для идентификации S. aureus.

Определение общего количества бактерий.По1 мл препа­рата, разведенного 1 :10, вносят в две пробирки с 4 мл расплавленного и охлажденного до 45— 50⁰ С 0,1% глюкозного МПА , перемешивают и выливают в две чашки Петри с МПА, которые инкубируют при 37⁰ С в течение 5 суток. Учитывают чашки, содержащие менее 300 колоний (наиболее достоверные результаты на чашках с числом коло­ний от 30 до 300), подсчитывая число бактериальных колоний с последующим расчетом количества бактерий в 1 г (мл) образца. При наличии большего числа колоний, делают ряд последовательных разведений (1:100; 1:1000 и т. д.), выбирая для посева наиболее подходящее разведение. Если в разведении 1:10 рост колоний отсутствует, в 1 г (мл) лекарственного средства содержится менее 10 бактерий.

Определение общего количества грибов проводятна среде Сабурос антибиотиками в чашке Петри с последующим выращиванием посевов при 24⁰ С 5 суток, учитывая все выросшие колонии.

Определение бактерий семейства Enterobacteriaceae. 10 г (мл) образца вносят в 100 мл среды обогащения для энтеробактерий, перемешивают и инкубируют при 37⁰ С в течение 24-48 ч. При наличии роста бактерий делают пересевы пет­лей на среду Эндо и висмут-сульфитный агар в чашках Петри с последующей инкубацией посевов при 37⁰ С в течение 24-48 ч. На среде Эндо энтеробактерии образуют крупные малинового цвета колонии с металлическим блеском (или без него) или розовые, бесцветные, блестящие, выпуклые колонии, диаметром 2-4 мм. На висмут-сульфитном агаре колонии черные с металлическим блеском, зеленоватые или коричневые. При микроскопии препаратов, приготовленных из этих колоний, обнаруживают грам-отрицательные палочки, не образующие спор. Выросшие колонии пересевают на скошенный глюкозный МПА, инкубируют при температуре 37⁰ С в течение 18-20 ч, после чего полученные чистые культуры пересевают на среду с феноловым красным для определения ферментации глюкозы (среда меняет цвет с красного на желтый) и на среду с нитратом калия для определения восстановления нитратов в нитриты. О наличии нитратов судят по появлению красного окрашивания после внесения в среду реактива Гисса. Выполняют тест на наличие цитохромоксидазы. Для этого полоску фильтровальной бумаги смачивают смесью 1% спиртового раствора нафтола-1 и 1% раствора N-диметил-р-фенилендиамина (в соотношении 2:3) и на нее наносят чистую культуру исследуемых бактерий. Положительная реакция на фермент характеризуется появлением синего окрашивания через 2-5 мин.

Наличие в исследуемых образцах грамотрицательных, оксидазонегативных, неспорообразующих палочек, ферментирующих глюкозу с образованием кислоты и газа (или только кислоты) и восстанавливающих нитраты в нитриты, но не обладающих цитохромоксидазой, свидетельствует о присутствии энтеробактерий в готовых лекарственных средствах и о непригодности последних к использованию. Количественное определение бактерий семейства Enterobacteriaceae, Е. coli и Salmonella осуществляют для оценки микробиологической чистоты субстанций, вспомогательных веществ растительного, животного или другого происхождения, а также готовых лекарственных средств, которые не могут быть подвергнуты антимикробной обработке.

Определение S. aureus и P. aeruginosa. 10 г (мл) образца готовых лекарственных средств вносят в 100 мл жидкой среды накопления солевого бульона, инкубируют при температуре 37⁰ С в течение 24-48 ч. При наличии роста бактерий делают пересевы петлей на среды для P. aeruginosa и солевой агар с маннитом для идентификации S. aureus. При контаминации готовых лекарственных средств синегнойной палочкой на среде для выявления ее пигмента вырастают зеленоватые флуоресцирующие колонии грамотрицательных неспорообразующих палочек, выделяющих в среду водорастворимый сине-зеленый пигмент и обладающих цитохромоксидазой.

Обнаружение на солевом агаре с маннитом золотисто-желтых колоний, содержащих плазмокоагулирующие грамположительные кокки в виде гроздьев винограда, свидетельствует о наличии в готовом лекарственном средстве золотистого стафилококка.

Для обнаружения бактерий рода Proteus 0,5 мл разведения 1:10 вносят в конденсационную воду свежескошенного МПА (посев по Шукевичу). При наличии ползучего роста через 24—48 ч выделяют чистую культуру протея и проводят ее идентификацию.

Наличие синегнойных бактерий и золотистых стафилококков в ГЛС свидетельствует о непригодности исследуемого лекарственного препарата для применения в медицинской практике.

Определение микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств, обладающих антимикробным действием.Эти препараты могут быть загрязнены микробами в связи с отсутствием антимикробного эффекта в отношении тех микроорганизмов, которые не входят в спектр специфического действия лекарственного средства. Например, химиотерапевтические препараты, проявляющие активность в отношении грамположительных бактерий, могут быть контаминированы грамотрицательными микроорганизмами, антибактериальные антибиотики широкого спектра действия - грибами. Степень микробной загрязненности зависит от спектра и уровней бактериостатического или бактерицидного действия лекарственного препарата, попадания в него микробов с приобретенной устойчивостью, наличия в лекарстве веществ, снижающих антимикробное действие препарата, действия других факторов.

Для контроля микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств, обладающих антимикробными свойствами, содержащими консерванты, а также стерильных лекарственных форм, сырья и вспомогательных веществ используют метод мембранной фильтрации.

Исследованию подвергают 1 л 0,5% раствора антибиотика или 10% суспензии из таблеток, содержащих антибиотик, растирая их в стерильных фарфоровых ступках с растворителем (феноксиметилпенициллин, ампициллина тригидрат, тетрациклин, олеандомицина фосфат растворяют в 1/15 М фосфатном буфере с рН 7,8-8,0, оксациллин и диклоксациллин в 0,9% растворе хлорида натрия). Для посевов используют МПА, среду Сабуро, среду Эндо, кровяной агар в чашках Петри. Для этого исследуемый образец в количестве 10 г (мл) помещают в мерный флакон, растворяя (суспендируя или эмульгируя) в фосфатном буферном растворе рН 7,0 до объема 100 мл. В качестве растворителя мазей и масляных ра­створов лекарственных средств используют изо-пропилмиристат.

Фильтрование проводят в асептических условиях с использованием специальной установ­ки, состоящей из фильтродержателя с воронкой и крышкой, основания из пористой пластины, на которую помещают мембранный фильтр, а также приемника. Для водных, масляных и слабоспиртовых растворов используют нитроцеллюлозные, для сильноспиртовых — ацетатцеллюлозные полимерные мембраны с размером пор 0,45±0,02 мкм, диаметром 47 мм. Фильтрование проводят под вакуумом 9,33 кПа (70 мм рт. ст.).

Исследуемый образец лекарственного средства фильтруют в объеме по 10 мл раствора через каждую из 6 мембран. Если лекарственное средство нерастворимо в воде и образует суспензию (таблетки, порошки и др.), фильтруют надосадочную жидкость.

Поскольку на фильтре остаются не только микробы, но и противомикробный препарат, после окончания фильтрации мембраны отмывают 1-5 порциями по 100 мл соответствующего растворителя, который не должен подавлять рост микроорганизмов (0,9 % раствора натрия хлорида, твин-80) .

После отмывания мембраны извлекают из фильтродержателя и помещают на следующие питательные среды:

• первые две мембраны - на поверхность глюкозного МПА в чашке Петри,
инкубируют при температуре 37⁰ С в течение 5 суток;

• третью и четвертую мембраны - на поверхность агара Сабуро в чашке Петри, иинкубируют при температуре 24⁰ С в течение 5 суток;

• пятую мембрану - в 100 мл среды обогащения для энтеробактерий, инкубируют при температуре 37⁰ С в течение 24-48 часов;

• шестую мембрану - в 100 мл среды обогащения для P. aeruginosa и S. aureus, инкубируют при температуре 37⁰ С в течение 24—48 часов.

• для количественного определения бактерий семейства Enterobacteriaceae две мембраны накладывают на поверхность среды Эндо в чашке Петри, инкубируют при температуре 37⁰ С в течение 48 часов.

Количественное определение бактерий и грибов.Посевы на глюкозном МПА и среде Сабуро просматривают ежедневно, раздельно определяя количество бактерий и грибов, с окончательным подсчетом колоний через 5 суток на мембранах с ростом до 100 колоний, делая перерасчет на 1 г образца. Если на поверхности мембраны нет роста микроорганизмов, делают заключение, что в исследуемом образце лекарственного средства бактерии (грибы) не обнаружены. Если число колоний на мембране больше 100, увеличивают разведения образца препарата (1:100, 1:1000 и т. д.), выбирая для фильтрации то разведение, при посеве которого на питательные среды количество колоний на мембране не будет превышать 100. В этом случае при определении числа микроорганизмов в 1 г (мл) среднее значение количества колоний, полученное на двух мембранах, умножают на соответствующий коэффициент разведения (10, 100 и т. д.).

Выявление и идентификацию бактерий семейства Enterobacteriaceae, видов Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus осуществляют по окончании инкубации, как описано для метода прямого посева.

Количественное определение бактерий сем. Enterobacteriaceae (Е. coli).Посевы на среде Эндо изучают в течение 24-48 часов. При наличии на мембранах роста типичных колоний грамотрицательных палочек, типичных для семейства Enterobacteriaceae, подсчитывают их число и выполняют перасчет на 1 г (мл) лекарственного препарата. Для количественного определения Е. coli в препарате подтверждают рост на среде Эндо в виде малиновых колоний с металлическим блеском или без него, либо розовых или серовато-кремовых колоний, окрашенных в цвет среды. Тест на цитохромоксидазу отрицателен, пробы на утилизацию цитрата натрия и индол положительны.