Биохимические и физико-химические процессы, протекающие при сбраживании пивного сусла

Основными результатами сбраживания пивного сусла являются снижение концентрации сусла, образование основных и побочных продуктов брожения, флокуляция дрожжей, снижение рН и rН₂, повышение температуры. Состав сусла во время брожения изменяется за счет сбраживания сахаров, потребления веществ сусла на построение новых дрожжевых клеток, выделения в среду продуктов обмена веществ дрожжами.

Сбраживание сахаров. В результате брожения в пиве накапливаются спирт, ди­оксид углерода и различные побочные продукты. До 75 % экстракта сусла состоит из сбраживаемых сахаров. Несбраживаемая часть эк­стракта представлена декстринами, белками и минеральными ве­ществами.

Диффузия сахара в дрожжевые клетки и спирта из клеток в среду как хорошо растворимых веществ зависит фактически только от градиента концентраций. В интервале концентраций сахаров в пив­ном сусле осмотическое давление изменяется пропорционально со­держанию сахара в среде. Благодаря сорбции сахаров дрожжевой клеткой на ее поверхности поддерживается достаточно высокая концентрация питательных веществ, что обеспечивает хорошие ус­ловия для диффузии сахара внутрь клетки. При этом уровень ад­сорбционного равновесия зависит от температуры среды: чем она выше, тем быстрее достигается равновесное состояние.

Отдельные сахара сусла сбраживаются в определенной последо­вательности в зависимости от скорости диффузии в дрожжевую клетку. Быстрее всех сбраживаются фруктоза и глюкоза. Однако сахароза исчезает из сусла также в начале брожения за счет того, что она инвертируется до глюкозы и фруктозы под дей­ствием фермента β-фруктофуранозидазы, находящейся на поверхности клеточной оболочки дрожжевой клетки.

После исчезновения моносахаров дрожжи начинают по­треблять мальтозу, предварительно гидролизуя ее ферментом α-глюкозидазой до глюкозы.

Более медленное сбраживание мальтозы и мальтотриозы дрожжами объясняется следующим. Прежде чем начнется процесс брожения проходит определенное время. За это время для сбраживания мальтозы и мальтотриозы дрожжи должны синтезировать не только гидролизующие ферменты, но и ферментативную систему переноса - транспорта (пермеазы), которая делает возможным поступление их в клетку. Установлено, что наиболее высокую скорость сбраживания саха­ров обеспечивают те расы, у которых максимальная бродильная активность наблюдается на третьи сутки брожения.

Трисахариды, содержащие связь α-1,6, дрожжами не сбраживаются.

Быстросбраживающие расы по сравнению со среднесбраживающими отличаются большей скоростью усвоения глюкозы и мальто­зы в начале процесса. У среднесбраживающих рас период, предшествующий началу потребле­ния мальтозы, более продолжителен. Для сбражи­вания пивного сусла, содержащего повышенную концентрацию глюкозы, целесообразно использовать дрожжи 11, 8а(М) - у них подавление активности системы транспорта мальтозы в клетку пре­кращается при сравнительно высокой концентрации глюкозы — 0,7 - 0,8 %. Если в сусле содержится более 1,5 % глюкозы, то умень­шается скорость размножения дрожжей, ухудшается флокулирующая способность дрожжей в пиве, воз­растает концентрация диацетила.

Изменение азотистого состава. Во время главного брожения изменяется содержание азотистых веществ из-за потребления, а затем выделения их дрожжевыми клетками, а также образования белково-полифенольных комплексов, вы­падающих в осадок при понижении рН и накоплении спирта.

Количество аминокислот сусла при брожении уменьшается про­порционально интенсивности размножения дрожжей. В конце бро­жения, когда прирост дрожжей прекращается, количество амино­кислот начинает увеличиваться вследствие образования аминокис­лот из белков сусла под действием протеолитических ферментов дрожжей.

При начальном содержании аминокислот в сусле (по азоту) 25 мг/100 см³ в период главного брожения их количество снижает­ся до 13 мг/100 см³, а в конце либо увели­чивается до 15 мг/100 см³, либо остается на том же уровне. При брожении потребляется примерно 25-40 % аминокислот сусла и 28 - 48 % общего азота сусла. Содер­жание общего азота ниже по сравнению с содержанием аминокислот, поскольку часть белков при сбраживании коагулирует и выпа­дает в осадок вместе с дрожжами.

Несмотря на то, что дрожжи могут синтезировать все аминокис­лоты, роль прямой ассимиляции их из сусла очень велика. Причем прямое использование аминокислот сусла обеспечивает наиболее быстрый рост дрожжей.

Различные аминокислоты потребляются дрожжами с разной скоростью. В период дображивания в наибольшей степени дрожжа­ми потребляются метионин, серии, цистеин - 49 - 60 % от общего их количества, усвоенного за весь цикл развития. Видимо, эти ами­нокислоты ответственны не только за биосинтез и действие фер­ментов, но и за процесс почкования и деления клеток. На всех дру­гих стадиях брожения в основном усваиваются глутаминовая кис­лота, фенилаланин и лейцин. В период логарифмической фазы рос­та дрожжи потребляют лейцин, лизин, тирозин, аминомасляную кислоту, фенилаланин, глутаминовую кислоту. В этой фазе они ус­ваиваются на 44 - 77 %.

Несмотря на то, что белковые вещества образуют незначитель­ную часть экстракта (от 3,1 до 5,6 %), они влияют на пенообразование и могут быть причиной помутнения пива. Это в первую очередь касается высокомолекулярных продуктов расщепления белков — альбумоз и пептонов.

Наибольшее потребление дрожжами азотистых веществ сусла происходит в начале главного брожения. Их количество в клетках достигает 40 – 45% содержания сухого вещества, дальнейшее усвоение клетками азотистых веществ не превышает нескольких процентов.

Изменение кислотности (рН).Молодое пиво по сравнению с исход­ным суслом имеет более высокую кислотность, его рН почти на целую единицу ниже. Кислотность повышает, с одной стороны, образующийся углекислый газ, с другой — органические кислоты, которые являются побочными продуктами спиртового брожения.

Нормальный рН пива находится в пределах от 4,4 до 4,0. Установлено, что при главном брожении, как только бродящее сусло насыщается углекислым газом, рН снижает­ся приблизительно до 4,4. Последую­щее снижение происходит уже не только под влиянием углекис­лого газа, даже при перенасыщении, но ив результате образова­ния органических кислот.

Кислотность очень благотворно влияет на вкусовые качества пива и на его биологическую стабильность.

Конечный рН молодого пива почти не зависит от рН исход­ного сусла. Однако здесь проявляются буферы, содержащиеся в сусле, главным образом фосфаты, под влиянием которых рН пи­ва не уменьшается ниже 4,0. Если предположить, что дрожжи того же типа образуют почти одинаковое количество кислот, то конечный рН пива тем ниже, чем меньше буферов было в сусле. Поэтому пиво, изготовленное из засыпи, содержащей замените­ли солода, главным образом сахар, имеет более низкий рН, чем пиво, полученное из чистого солода.

При брожении сусла система буферов изменяется, с одной стороны, в результате потребления дрожжами фосфатов и при фосфорилировании, с другой — вследствие образования органи­ческих кислот, которые в присутствии соответствующих солей функционируют как буферы.

Влияние семенных дрожжей в целом незначительно и выте­кает из несколько отличающегося образования кислот отдельны­ми расами дрожжей. Известно, что пиво из более интен­сивно бродящего сусла имеет более низкий рН. Более низкий рН имеет также и пиво, инфицированное кислотообразующими бактериями.

Образование побочных продуктов брожения. Главным продуктом спиртового брожения является этиловый спирт, слабый водный раствор которого почти безвкусен и поэтому не оказывает значительного влияния на вкус пива. Более активными в этом отношении являются побочные продукты брожения: высшие спирты, эфиры карбоновых кислот, карбонильные соединения, карбоновые кислоты, альдегиды, кетоны.

Образование побочных продуктов брожения и синтез запасных веществ дрожжей зависят от условий процес­са. Значительное влияние на этот процесс оказывает азотный обмен дрожжей и скорость размножения. Некоторые продук­ты (например, пируват) накапливаются при размножении, другие (ацетат) - когда дрожжевые клетки не рас­тут. Так как на построение биомассы дрожжей исполь­зуется часть энергии, полученной от брожения, то изме­нение степени роста означает, что больше или меньше энергии может быть использовано для синтеза побочных продуктов брожения. Например, при стимулировании роста дрожжей образуется меньше эфиров и больше высших спиртов.

Из высших спиртов (их в сброженных продуктах найдено около 50) основную массу составляют изоамиловый, изобутиловый и пропиловый – примерно 90%. Механизм образования побочных продуктов имеет большой теоретический и практический интерес. Установлено, что при образовании высших спиртов протекают два процесса: декарбоксилирование и гидролитическое дезаминирование.

Аминокислота сначала дегидрируется в иминокислоту и че­рез реакцию с водой при отщеплении аммиака переходит в соот­ветствующую α-карбоновую кислоту, из которой путем декарбоксилирования образуется альдегид, который затем восстанав­ливается в соответствующий алкоголь.

 

Таким образом, из лейцина образуется изоамиловый спирт, содержание которого достигает 70% к общему количеству си­вушных масел.

Из изолейцина образуется активный амиловый спирт, из валина - изобутиловый спирт.

Кроме того, высшие спирты могут быть образованы и без участия аминокислот, а именно через уксусную кислоту: уксусная кислота —> ацетоацетат —> ацетоин —> изопропанол, или ацетон + ацетальдегид —> ββ-диметилакролеин —> 2-пен­танол (изоамиловый спирт). Таким путем изовалериановая кислота превращается в изоамиловый спирт.

В некоторых случаях последняя стадия высшего спирта может заканчиваться не реакцией восстановле­ния, а реакцией окисления; в этом случае вместо спирта образу­ется кислота, например, янтарная.

Амино­кислоты превращаются в соответствующие спирты только в при­сутствии сбраживаемого сахара.

Содержание высших спиртов в пиве количественно и качест­венно зависит от состава сусла, от вида и количества присутствующих аминокислот, от типа дрожжей, нормы их введения, аэрации и других факторов. В пиве они появ­ляются уже в начале брожения и их количество возрастает в течение периода брожения.

Альдегиды и кетоны – это продукты превращения углеводов и аминокислот. Альдегиды образуются при декарбоксилировании кетокислот. Кроме того, альдегиды при брожении могут образовываться также при окислении спиртов, причем как ферментативным, так и химическим путем. Из альдегидов в пиве преобла­дает ацетальдегид, придающий пиву незрелый вкус.

При низкой концентрации присутствие в пиве аце­тальдегида не проявляется ни в запахе, ни во вкусе. И наоборот, производные ацетальдегида, главным образом диацетил и ацетоин, оказывают неблагоприяное влияние на органолептику пива.

Диацетил образуется при брожении не только в пиве, инфицированном педиококками или молочными бактериями, но и при развитии культурных рас пиво­варенных дрожжей. Содержание в пиве диацетила до 0,2 мг/л считается нормальным. Более высокое его содержание придает пиву нежелательный, неприятный (медовый) запах и привкус.

Исходным продуктом для синтеза диацетила являются пировиноградная кислота и тиаминпирофосфат, а также Мп²⁺ или Mg²⁺. Процесс в этом случае катализиру­ют последовательно ферменты пируватдекарбоксилаза,ацетолактатдекарбоксилаза,α-ацетолактатсинтетаза.

По другому вариан­ту дрожжи в присутствии NAD превращают пировиноградную кислоту в ацетил-СоА, который, конденсируясь с другой молеку­лой пировиноградной кислоты, образует α-ацетомолочную кис­лоту с последующим декарбоксилированием ее в ацетоин. Превра­щение ацетоина в диацетил катализируют ацетоиндегидрогеназа и NADH₂. Схема реакций синтеза дрожжами ацетоина и диацетила следующая:

 

СН₃

Ацетоин, так же как и диацетил, влияет на вкус пива и является причиной так называемого подвального (затхлого) привкуса пива (свыше одного мг/дм³).

Диацетил и ацетоин образуются на пер­вой стадии брожения, когда дрожжи сильно размножаются и про­исходит энергичный азотистый обмен веществ. Слишком позднее аэрирование, вызывающее новый синтез дрожжевой массы, приводит к образованию ацетоина и одновременно стимулирует его окисление до диацетила. Наличие сбраживаемого сахара повышает способность дрожжей восстанавливать диацетил.

Три соединения — ацетоин, диацетил и 2,3-бу­тандиол образуют в пиве окислительно-восстановительную систе­му. В зависимости от активности действующих в этой системе фер­ментов превалируют те или иные продукты превращения. Если в пиве преобладают восстановительные процессы, то накапливается 2,3-бутандиол. В аэробных условиях увеличивается количество аце­тоина и диацетила, ухудшающих качество пива.

Дрожжи обладают способностью восстанавливать диацетил в 2,3-бутандиол в стадии активного размножения. Более низкие концентрации диацетила, которые могут быть получены в пиве врезультате редукции живыми дрожжами, равны 0,2 мг/ дм³. Установлено, что на практике запах диацетила можно уда­лить из пива путем добавления свежих густых дрожжей от 0,5 до 1,0 дм³/гл.

Сложные эфиры, являющиеся главной составной частью запаха (букета) пива, образуются при сбраживании сусла из летучих и нелетучих органических кислот и спиртов в результате реакций, катализируемых эстеразами дрожжей, т.е. реакций этерификации (биологическая этерификация).

Кроме того, эфиры накапливаются также и при биосинтезе в дрожжевых клетках. Установлено: образование сложных эфиров может происходить по реакции между альдегидами как исходными продуктами образования кислот и высших спиртов. Анализы показывают, что при реакции этерификации уменьшается концентрация альдегидов, а не кислот, т.е. в этом случае имеет место химическая этерификация.

По мере уменьшения в среде концентраций спирта и кислоты скорость образования сложных эфиров уменьшается и в определенный момент в системе устанавливается подвижное равновесие, после которого их количество не увеличивается.

Общее содержание сложных эфиров в пиве колеблется от 35 до 83 мг/дм³: при низовом брожении всегда образуется сложных эфиров меньше, чем при верховом. При бро­жении большую часть эфиров захватывает улетучивающийся уг­лекислый газ. При брожении крепкого сусла (с более высокой концентрацией) и сусла, полученного с добавлением заменителей солода, сложных эфиров образуется больше.

Присутствие сернистых соединений, сероводорода и меркаптанов считается основной причиной непри­ятного (незрелого) вкуса молодого пива. Для синтеза органиче­ских сернистых соединений дрожжи используют серу из сульфа­тов, сульфитов и азотистых соединений, содержащих серу.

В сырье и производственном цикле обнаружено следующее коли­чество серы:

- в солоде 79, в хмеле 97, в дрожжах 715 мг на 100 г сухого остатка;

- в сусле около 65 мкг/дм³;

- в бродильных газах от 48,5 до 84,7 мкг/м²;

- в молодом пиве от 42,6до 58,8 мкг/ дм³;

- в готовом пиве от 42,6 до 47,5 мкг/ дм³.

Если брожение протекает медленно, то в бродильные газы се­роводорода переходит больше, чем при быстром ходе брожения.

Содержание летучих меркаптанов при брожении снижается, в то время как при дображивании возрастает. Меркаптаны образуются при главном брожении и их содержание достигает при этом своего максимума (около 60%); при использовании хлопьевидных дрожжей в пиве содержится больше меркапта­нов (0,97 мг/дм³), чем при применении пылевидных дрожжей (0,5 мг/дм³). Образова­ние меркаптанов поддерживают взвеси, попавшие в сусло.

Кислород, редуцирующие веществами rН₂.Кислород, содержа­щийся в сбраживаемом сусле, используется для дыхания уже в процессе размножения в начале брожения. Де Клерк [35] обнару­жил в конце брожения остаточный кислород (0,25 мг/л).

Редуцирующие вещества при брожении почти не изменяются.

Окислительно-восстановительный потенциал rН₂ при броже­нии снижается с 20 в исходном сусле до 11в молодом пиве.

Содержание изогумулонов и полифенолов.Содержание изогумулонов при брожении резко уменьшается в зависимости от вида применяемых дрожжей: на 9,4% при использовании дрожжей седиментирующих и на 13,4% при применениипылевидных дрожжей. Считается, что потери возникают в результате адсорб­ции этих веществ на дрожжах и поэтому зависят от размноже­ния клеток; последующие потери возникают вследствие увлече­ния изогумулона бродильными деками вместе с пузырьками угле­кислого газа.

Полифенольные (дубильные) вещества также уменьшаются при брожении и потери их достигают 1/3.

Цвет пива.Пиво всегда имеет менее интенсивную окраску по сравнению с исходным суслом. Потеря цветности связана прежде всего с более низким рН бродящего сусла, при котором красящие вещества сусла (меланоидины) приобретают более светлый цвет. Одновременно часть красящих веществ адсорбируется на по­верхности дрожжей и на пузырьках углекислого газа, которые поднимаются к деке.

Сусло наиболее сильно обесцвечивается в результате роста кислотности. Меньшее влияние оказывает удаление углекислого газа и самое меньшее — редукция.

Светлое молодое пиво по сравнению с исходным суслом имеет цвет ниже на 0,20 - 0,30 см³ 0,1 моль/дм³ раствора йода. У темных сор­тов пива это снижение из-за интенсивного цвета не так заметно.