Определение активности АсАТ.

1. Внесите в пробирку 0,5 мл субстратно-буферной смеси для определения активности АсАТ и добавьте в пробирку 0,1 мл сыворотки крови.

2. Поместите пробирку в термостат на 15 минут, температура 37 С.

3. Затем добавьте в пробирку 0,5 мл раствора 2,4 –динитрофенилгидразина.

4. Реакционную смесь необходимо выдержать в течение 20 минут при комнатной температуре,

5. Далее добавьте в пробирку 5 мл 0,4М раствора едкого натра и оставьте раствор на 10 минут при комнатной температуре для стабилизации окраски.

6. Через 10 минут необходимо измерить оптическую плотность раствора на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 500 – 560 нм) в кювете толщиной 1 см.

Определение активности АлАТ.

1. Внесите в пробирку 0,5 мл субстратно-буферной смеси для определения активности АлАТ и добавьте в пробирку 0,1 мл сыворотки крови.

2. Поместите пробирку в термостат на 30 минут, температура 37 С.

3. Затем добавьте в пробирку 0,5 мл раствора 2,4 –динитрофенилгидразина.

4. Реакционную смесь необходимо выдержать в течение 20 минут при комнатной температуре,

5. Далее добавьте в пробирку 5 мл 0,4М раствора едкого натра и оставьте раствор на 10 минут при комнатной температуре для стабилизации окраски.

6. Через 10 минут необходимо измерить оптическую плотность раствора на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 500 – 560 нм) в кювете толщиной 1 см.

Для определения активности обоих ферментов Вам необходимо построить калибровочные графики. При построении калибровочного графика на оси ординат необходимо отложить значения оптической плотности, а на оси абсцисс - содержание пировиноградной кислоты (ПВК) в калибровочных пробах (в мкмолях). Активность ферментов в данных условиях исследования (в мкмолях ПВК, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки за 1 час), рассчитывается по формулам:

 

Х=10 х С (для АсАТ) и Х=10 х 2 х С (для АлАТ), где:

С- количество ПВК по калибровочному графику (в мкмолях);

10-коэффициент перерасчета на 1 мл сыворотки;

2- коэффициент перерасчета на 1 час инкубации.

 

Лабораторные нормы: для АсАТ - 0,1- 0,5 мкмолей ПВК на 1 мл сыворотки крови за 1 час инкубации, для АлАТ - 0,1-0,7 мкмолей ПВК на 1 мл сыворотки крови за 1 час инкубации.

 

Калибровочные графики зависимости оптической плотности растворов ПВК от содержания ПВК:

а) для определения активности АсАТ:

 

б) для определения активности АлАТ:

 

ВЫВОДЫ:

 

 

Подпись преподавателя:

 

Приложение 1