Работа 1. Изучить функционирование ЦТК по убыли ацетил –КоА.
Принцип метода: первым этапом ЦТК является реакция конденсации ацетил-КоА с оксалоацетатом, которая осуществляется цитратсинтазой. Образовавшаяся лимонная кислота подвергается превращению в цикле трикарбоновых кислот, а освободившийся КоА-SH можно определять, используя реактив Фолина (появляется синее окрашивание). Если блокировать ЦТК малоновой кислотой, то ацетил-КоА не используется и КоА-SH не образуется.
Материальное обеспечение:
Фосфатный буфер рН=7,4, раствор ацетил –КоА, раствор оксалоацетата, раствор малоновой кислоты, физиологический раствор, гомогенат митохондрий, реактив Фолина А, реактив Фолина В, пипетки, пробирки.
Ход работы:
Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:
№№ Содержимое пробирок Контроль Опыт
1. Фосфатный буфер рН=7,4 2,0 мл 2,0 мл
2. Р-р ацетил –КоА 0,5 0,5
3.. Р-р оксалоацетата 0,5 0,5
4. Р-р малоной кислоты 1,0 -
5. Физиологический р-р - 1,0
6. Гомогенат митохондрий 0,5 0,5
Инкубация 10 минут при комнатной температуре.
7. Реактив Фолина А 0,5 0,5
8. Реактив Фолина В 0,5 0,5
Результат (окраска растворов).
Выводы: 1. Напишите исследуемую реакцию ЦТК
2. Приведите реакцию ЦТК, которая ингибируется малоновой кислотой. Сравните формулы субстратов и малоната.
3. Определите тип ингибирования.
Работа 2. Изучить функционирование ЦТК по образованию углекислого газа.
Принцип работы : при окислении ацетил-КоА в ЦТК образуется углекислый газ, который связывается гидроксидом кальция и определяется при добавлении серной кислоты по выделению пузырьков газа.
Материальное обеспечение:
Фосфатный буфер рН=7,4, раствор ацетил –КоА, раствор оксалоацетата, раствор малоновой кислоты, физиологический раствор, гомогенат митохондрий, , раствор Са(ОН)2, 0,1 н серная кислота, пипетки, пробирки.
Ход работы:
Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:
№№ Содержимое пробирок Контроль Опыт
пп___________________________________________________________________________
1. Фосфатный буфер рН=7,4 2,0 мл 2,0 мл
2. Р-р ацетил-КоА 0,5 0,5
3. Р-р оксалоацетата 0,5 0,5
4. Р-р малоновой кислоты 1,0 -
5. Физиологический р-р - 1,0
6. Р-р Са(ОН)2 1,0 1,0
7. Гомогенат митохондрий 0,5 0,5
Инкубация 10 минут при комнатной температуре.
8. 0,1 н.р-р серной кислоты 1,0 1,0
Результаты (выделение углекислого газа).
Выводы: 1. Напишите реакции ЦТК, которые сопровождаются выделением СО2
Работа №3 Изучить функционирование ЦТК по образованию атомов водорода.
Принцип работы : При окислении ацетил-КоА в ЦТК образуется 8 атомов водорода, которые отщепляются при участии соответствующих дегидрогеназ, в качестве акцептора используется 2,6-дихлорфенолиндофенол (2,6-ДХФИ). Если цикл функционирует, то 2,6-ДХФИ восстанавливается и обесцвечивается.
Материальное обеспечение:
Фосфатный буфер рН=7,4, раствор ацетил –КоА, гомогенат митохондрий, раствор ЩУК, 0,001н раствор ДХФИ, бидистилят, пипетки, пробирки.
Ход работы:
Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:
№№ Содержимое пробирок Контроль Опыт
1. Фосфатный буфер рН=7,4 2,0мл 2,0мл
2. Р-Р ацетил-КоА - 0,5
3. р-р Щ У К - 0,5
4. Бидистиллят 1,0 -
5. 0,001 н. р-р ДХФИ 1,0 1,0
6. Гомогенат митохондрий 1,0 1,0
Инкубация 15-20 минут при комнатной температуре.
Результаты (окраска растворов).
ВЫВОДЫ:
1. Напишите дегидрогеназные реакции ЦТК, укажите ферменты и коферменты этих реакций.
Подпись преподавателя:
Приложение 1.