Механизм сплайсинга

Последовательности элементов в гяРНК, которые направляют удаление интронов, представляют собой короткие участки на каждом конце интрона. Практически всегда первые два нуклеотида в интроне, называемые донором сплайсинга или 5^/-сайтом сплайсинга представлены GU, а два других нуклеотида в интроне, называемые акцептором сплайсинга или 3^/-сайтом сплайсинга представлены AG (рис. 1). Фланкирующие последовательности экзонов также проявляют определенную степень консервативности. Вдобавок в интроне присутствует ключевой адениновый нуклеотид – А, представляющий собой точку ветвления интрона (рис. 1), который расположен в пределах консервативной последовательности на расстоянии в 30 нуклеотидов левее 3^/-сайта сплайсинга. Следующий раздел описывает последовательность реакций, которые протекают в ходе сплайсинга, а также роль белков и вспомогательных молекул РНК, облегчающих процесс удаления интронов.

 

 

Рис. 1

Сигналы сплайсинга. А – Правильному удалению интронов способствует присутствие специфических элементов отличающихся крайне высокой консервативностью – 5/-сайта сплайсинга, точки ветвления и 3/-сайта сплайсинга. Показано, что структура 5/- (GU) и 3/- (AG) сайтов сплайсинга отличается абсолютной консервативностью. Точка ветвления представлена ключевым остатком аденозина (А), играющим центральную роль в сплайсинге. У млекопитающих последовательности нуклеотидов пре-иРНК, окружающие этот остаток аденозина менее консервативны, чем у дрожжей и включают более 10 пиримидиновых нуклеотидов расположенных между точкой ветвления и 3/-сайтом сплайсинга. В – Последовательность событий в процессе сплайсинга пре-иРНК. Показано необычное строение точки ветвления, где все три ОН-группы рибозы ключевого аденозина (5/-, 3/- и 2/-ОН-группы) включены в образование фосфодиэфирных связей, что обеспечивает формирование структуры петли (вставка).

 

Анализ сплайсинга в бесклеточных экстрактах показал, что этот процесс включает две реакции переэтерификации(трансэтерификации). Термин трансэтерификация относится к явлению атаки эфирной связи [в данном случае речь идет о фосфодиэфирной связи] атомом кислорода активированной гидроксильной группы. Поскольку при этом одна фосфодиэфирная связь расщепляется, в то время как другая образуется, энергия связи в реакции трансэтерификации сохраняется. Другими словами данная реакция не является АТР-зависмой.

В ходе первой реакции трансэтерификации атом кислорода 2^/-ОН-группы рибозы аденинового нуклеотида в точке ветвления интронаосуществляет нуклеофильную атаку 5^/-сайта сплайсинга. Нужно отметить, что в этом случае точка ветвления интрона и 5^/-сайт сплайсинга должны быть физически сближены. Эта реакция высвобождает левый экзон и связывает адениновый нуклеотид с 5^/-концом интрона необычной 2^/-5^/-связью, в то время как обычные 3^/-5^/-связи продолжают связывать этот адениновый нуклеотид с его соседями (рис. 2). В результате этой первой реакции интрон образует внутримолекулярную петлю, называемую лассо.

 

 

В ходе второй реакции трансэтерификации атом кислорода 3^/-концевой ОН-группы высвобожденного ранее левого экзона атакует 3^/-сайт сплайсинга (акцептор сплайсинга), что приводит к ковалентному соединению левого и правого экзонов, завершая тем самым выщепление интрона. Выщепленная петля интрона превращается впоследствии в линейную молекулу под действием дебранчинг-фермента и быстро разрушается.

 

Малые ядерные РНК (snRNA) и сплайсисома

 

Реакции сплайсинга осуществляются крупным РНК-белковым комплексом, называемым сплайсисомой, который по своим размерам сравним с рибосомой. Ключевыми компонентами сплайсисомы являются пять малых ядерных рибонуклеопротеидных частиц – мяРНП (snRNP– «snurps»). Каждая мяРНП-частица состоит из малой ядерной РНК – мяРНК(snRNA) связанной с 10-20 белками. В реакциях сплайсинга пре-иРНК принимают участие мяРНК, обозначаемые символами U1, U2, U4, U5 и U6. Некоторые из белков мяРНП-частиц входят в состав всех мяРНП-комплексов, как, например, семь Sm-белков, которые распознаются антителами, вырабатывающимися у некоторых больных с аутоиммунным заболеванием – системной красной волчанкой. Другие белки, обнаруживаемые в мяРНП-комплексах проявляют более высокую специфичность и могут быть связаны только с одной единственной мяРНК. В целом сплайсисомы содержат также множество дополнительных белков, включая белки гяРНП-комплексов, которые предназначены для быстрой упаковки молекул гяРНК на стадии их образования, а также, так называемые SR-белки. Последние богаты серином ( S ) и аргинином ( R ) и их функция состоит в объединении мяРНП-комплексов и других факторов сплайсинга в целую сплайсисому используя белок-белковые взаимодействия. Изучение мутантов дрожжей с нарушением процессинга пре-РНК – prp-мутантов – позволило сделать вывод о том, что в сплайсинге в сумме принимают участие, по крайней мере, 100 различных белков. Такое количество разных белков кодируется приблизительно 2% генома дрожжей, что указывает на сложность процесса сплайсинга РНК и его огромное значение для клетки.

Взаимодействия, возникающие между пре-иРНК и молекулами мяРНК, а также между одной мяРНК и другой мяРНК за счет спаривания их оснований в совокупности со стабилизационной функцией белков заставляют 5^/- и3^/-сайты сплайсинга, а такжеточку ветвления интрона приобретать соответствующую пространственную структуру, необходимую для процесса сплайсинга (рис. 3). При этом каждая мяРНП-частица выполняет конкретную, согласованную во времени функцию.

Как следует из рис. 3малая ядерная РНК U1 ответственна за начальное узнавание 5^/-сайта сплайсинга посредством спаривания ее оснований с последовательностью окружающей сайт GU на левом конце интрона. Затем малая ядерная РНК U2 спаривается с областью точки ветвления интрона, заставляя адениновый нуклеотид экспонироваться для последующего взаимодействия 2^/-ОН-группы его рибозильного остатка с 5^/-концом интрона (рис. 3). У дрожжей малая ядерная РНК U2 спаривается с очень консервативной последовательностью UACUAA^*C в то время как у млекопитающих (в пре-иРНК, которых последовательность, окружающая точку ветвления А, менее консервативна – PyNPyPyPuA^*Py) процесс узнавания точки ветвления малой ядерной РНК U2 облегчается фактором U2AF – белком, который связывает кластер из остатков U и С (называемый полипиримидиновым участком) в 3^/-области интрона. Образованный на предыдущей стадии процесса сплайсинга тройной комплекс, который включает пре-иРНК, U1-мяРНК и U2-мяРНК, соединяется затем с другим тройным комплексом, построенным из трех мяРНП-частиц, содержащих малые ядерные РНК U4, U5 и U6. Малая ядерная РНК U5 удерживает концы соседних экзонов в составе пре-иРНК вместе, а U4-мяРНК, роль которой состоит в том, что она действует как шаперон, высвобождается из комплекса с U6-мяРНК, которая впоследствии вытесняет U1, спариваясь с 5^/-концом интрона. Малая ядерная РНК U6 также удерживает U2-мяРНК,обеспечивая тем самым сближение и удерживание рядом аденинового нуклеотида в области точки ветвления интрона и 5^/-конец интрона. Полагают, что малая ядерная РНК U6 играет центральную роль в реакции сплайсинга. Описанные выше взаимодействия все вместе способствуют активации и экспонированию ключевого аденинового нуклеотида в точке ветвления интрона в пре-иРНК и инициируют, тем самым, первую реакцию трансэтерификации. Заметьте динамическую природу различных РНК:РНК-взаимодействий в сплайсисоме по ходу реакции сплайсинга.

return false">ссылка скрыта

 

Рис. 3

Взаимодействие малых ядерных РНК с пре-иРНК обеспечивает согласованное протекание сплайсинга. Как только завершается синтез пре-иРНК с ее 5/-сайтом сплайсинга и точкой ветвления путем комплементарного взаимодействия связываются мяРНП-частицы включающие мяРНК U1 и U2, соответственно. У млекопитающих связыванию U2 способствует белок U2AF, который взаимодействует с полипиримидиновым участком и 3/-сайтом сплайсинга. U5 мяРНК участвует в сплайсинге в качестве компонента тройного комплекса с молекулами U4 и U6 мяРНК. В этом случае выступающая на двухспиральном стебле петля U5 мяРНК спаривается с двумя нуклеотидами экзона 1 и первыми двумя нуклеотидами экзона 2. Это приводит к сближению двух фосфодиэфирных связей, которые должны быть расщеплены и реорганизованы в ходе сплайсинга. В составе тройного комплекса U5·U4·U6 U4-мяРНК действует в качестве шаперона, спариваясь на большой протяженности с молекулой U6-мяРНК. Это спаривание впоследствии разрушается с тем, чтобы U6-мяРНК получила возможность спариться с U2-мяРНК вблизи активированной точки ветвления А. Поскольку U5-мяРНК и U6-мяРНК формируют описанные выше взаимодействия с пре-иРНК, молекула U1-мяРНК покидает комплекс, обеспечивая доступ U6-мяРНК к 5/-сайту сплайсинга (не показано). В ходе реакции трансэтерификации в 5/-сайте сплайсинга расщепляется фосфодиэфирная связь и в конечном итоге происходит соединение экзона 1 и экзона 2.

 

 

Недавно был выявлен похожий на описанный выше набор минорных мя-РНП-частиц. Они участвуют в катализе сплайсинга необычного класса интронов, которые не подчиняются «правилу GU/AG». Эти интроны включают последовательности AU и AC в 5^/- и 3^/-сайтах сплайсинга, соответственно. В таких случаях вместо U1- и U2-мяРНК используются U11- и U12-мяРНК, а вместо малых ядерных РНК U4 и U6 используются специфические мяРНК U4_atac и U6_atac. Что касается U5 мяРНП-частиц, то они входят в состав обоих видов сплайсисом. Во всех остальных отношениях, механизм сплайсинга интронов, подчиняющихся «правилу AU/AC», по-видимому, аналогичен обычному механизму сплайсинга.