Метод регистрации индукционной кривой флуоресценции.

При включении возбуждающего света можно наблюдать характерную индукционную кривую флуоресценции, в которой различают несколько фаз (Рис.5). Параметры кинетики изменения амплитуды флуоресценции хлорофилла а обладают большой информативностью для характеристики состояния первичных процессов фотосинтеза. Это связано с тем, что изменения состояния фотосинтетического аппарата сопровождаются изменением вероятности тушения энергии электронного возбуждения молекул хлорофилла, что и проявляется в изменении квантового выхода флуоресценции при освещении (эффект Каутского). Сложная индукция нарастания переменной флуоресценции хлорофилла отражает последовательное заполнение различных пулов пластохинона на акцепторной стороне ФС2, а кинетика затухания – гетерогенность окисления восстановленного пула. Начальный уровень O (original) соответствует так называемой постоянной флуоресценции Fo, излучаемой при окисленном акцепторе Qa. Такое состояние достигается путем длительной темновой адаптации объекта или освещении его дальним красным светом, возбуждающим ФС1.

А

Б

Рис.5. А – Типичная индукционная кривая флуоресценции зеленого листа или зеленых водорослей при включении возбуждающего света, в которой различается несколько фазовых переходов. Б – Быстрая фаза индукционной кривой роста флуоресценции хлорофилла (OJIP). Переходы приведены в логарифмическом масштабе времени от 50 мкс до 1 сек. Обозначения в (Ο) относятся к выбранным данным флуоресценции и используются в JIP-тесте для расчета структурных и функциональных параметров. Сигналы: F₀ интенсивность флуоресценции (при 50 мкс); интенсивность флуоресценции F_J (при 2 мс), F_I (при 30 мс); максимальная интенсивность флуоресценции, F_P=F_m (в момент обозначается как t_Fm).

Изменения O-I-D-P называют быстрой индукцией флуоресценции. Она протекает за 1–3 с в зависимости от интенсивности света и других факторов. Более медленные изменения индукции флуоресценции P-S-M-T протекают за время от нескольких десятков секунд до нескольких минут.

 

Возрастание выхода флуоресценции от уровня О до уровня Р (peak) представляет собой переменную флуоресценцию Fv и происходит вследствие восстановления Qa при освещении. При длительной предварительной темновой адаптации образца, которая приводит к инактивации темновых реакций фиксации двуокиси углерода, или при достаточно высокой интенсивности действующего света, выход флуоресценции на уровне P может быть равен Fm. Возрастание замедляется в точке I (infection), после чего иногда следует некоторое снижение выхода до уровня D (dip).

Переход OID отражает изменение степени восстановленности Qa в цепи транспорта электронов в условиях полного окисления пула NADP после ФС1, когда стадией, лимитирующей скорость потока электронов, является окисление пластохинона. Спад D обусловлен окислением Qa в реакциях ФС1, после быстрого восстановления его в ФС2 (Рис.5.).

По мере восстановления пула НАДФ скорость потока электронов начинает ограничиваться реакциями окисления НАДФ–Н. Это связано с тем, что состояние темновой адаптации характеризуется низкой активностью использования восстановленного НАДФ вследствие недостаточного количества промежуточных продуктов в цикле восстановления СО₂, а также инактивации в темноте некоторых ферментов этого цикла. Увеличение выхода флуоресценции в фазе DP отражает смещение квазистационарного состояния в сторону большей восстановленности Qa в результате восстановления пулов НАДФ и пластохинона. Одной из причин медленного последующего спада от Р до S (stasionary), за которым следует одна или несколько волн М (maximum)–T (terminal), является ускорение транспорта электронов в результате световой активации реакций восстановления СО₂. Это медленное тушение флуоресценции вызывается не только окислением Qa, но и так называемыми процессами нефотохимического тушения, приводящими к безызлучательному тушению возбуждения в реакционных центрах ФС2 и к перераспределению энергии возбуждения между фотосистемами в пользу фотосистемы 1, имеющей при комнатной температуре низкий квантовый выход флуоресценции. Развитие процессов нефотохимического тушения вызывается целым рядом процессов, таких как возникновение электрохимического градиента протонов на мембране, тушение каротиноидами, циклический перенос электронов в ФС2, и фоторазрушение реакционных центров ФС2.

Использование импульсных флуориметров позволило существенно расширить возможности для расшифровки механизмов процессов, происходящих при включении и выключении постоянного освещения. В адаптированных к темноте листьях все центры фотохимически активны и флуоресценция соответствует уровню F₀. При освещении их насыщающей вспышкой флуоресценция становится максимальной (F_m) и быстро релаксирует в темноте до исходного уровня. На постоянном свету происходит частичное восстановление Q_A. Освещение образца на этом фоне постоянного освещения насыщающей фотосинтез вспышкой увеличивает уровень флуоресценции но только до величины F_m', меньшей чем F_m, т.к. имеет место нефотохимическое тушение флуоресценции, связанное с диссипацией части энергии возбуждения в РЦ и фотосинтетической антенне. Оно обусловлено по крайней мере тремя процессами: энергизационным ΔрН-зависимым тушением, уменьшением сечения поглощения ФС2 вследствие перехода части фосфорилированных ССК к ФС1 и фотоингибированием ФС2. Таким образом, разница между максимальной флуоресценцией F_m и F_m' обусловлена той частью флуоресценции, которая тушится за счет нефотохимических процессов. Все эти процессы отражаются на кинетической кривой, которая имеет немонотонный характер. При длительной экспозиции листьев на сильном свету флуоресценция сначала возрастает до F_m, затем снижается до F_m' за счет нефотохимического тушения.

 

O-J-I-P кинетика световой индукции флуоресценции хлорофилла.

 

Усовершенствование регистрирующей части кинетических флуориметров позволило увеличить временное разрешение измерений до 10 мкс. В результате стало возможным фиксировать очень быстрые изменения флуоресценции хлорофилла а, происходящие при освещении листа или водорослей светом высокой интенсивности (3000 мкЕ/м²с). Типичная индукционная кривая, получаемая при данном способе измерений, характеризуется кинетикой O-J-I-P (латинскими буквами обозначены фазы индукционной кривой, разрешаемые в логарифмической шкале времени) (Рис.5). Уровень, обозначенный как O на кинетической кривой соответствует минимальной флуоресценции Fо, а P - максимальной флуоресценции Fm.

 

 

Фаза J-I-P отражает, главным образом, дальнейшее накопление восстановленного Qa^-, обусловленное восстановлением Qb и пула хинонов, т.е. последовательным накоплением Qa^-Qb, Qa^-Qb^2-, и PQH₂ состояний. Для проведения количественного анализа характеристик первичных процессов фотосинтеза на основе параметров кинетической кривой O-J-I-P был предложен так называемый «JIP-тест». JIP-тест оперирует следующими параметрами кинетической кривой индукции флуоресценции: (а) интенсивностью флуоресценции при 50 мкс, 100 мкс и 300 мкс, 2 мс, 30 мс и 6 с; (б) временем достижения максимальной флуоресценции (tFm) и (в) площадью над кинетической кривой до уровня Fm.(см. таблицу). Эти параметры используются для расчета характеристик первичных процессов фотосинтеза, приведенных в методах. Многие параметры JIP-теста являются взаимозависимыми (т.е. изменение одних приводит к изменению других). Независимые параметры (V_J, W и M_О), полученные из анализа фазы O-J, обеспечивают информацией о восстановлении Qa. Из параметров (V_I, S_M), можно получить информацию о дальнейшем накоплении восстановленного Qa^-, которое происходит в результате восстановления Qb и пула хинонов. С помощью JIP-теста удается исследовать чувствительность фотосинтеза к действию различных стрессов и загрязнений.

Табл. Измеряемые и рассчитанные параметры флуоресценции в JIP-тесте.

Измеряемые параметры флуоресценциии
Fo	Интенсивность флуоресценции при 50 мкс
FJ	Интенсивность флуоресценции при 2 мс
FI	Интенсивность флуоресценции при 20 мс
FP(=Fm)	Максимальный выход флуоресценции
F100мкс	Интенсивность флуоресценции при 100 мкс
F300мкс	Интенсивность флуоресценции при 300 мкс
F6c	Интенсивность флуоресценции при 6 с
t(Fm)	Время (мс) достижения максимальной флуоресценции FM
Area	Площадь между кинетической кривой флуоресценции (O-J-I-P) и уровнем FM
Параметры JIP-теста
FV=Fm–Fo	Максимальная переменная флуоресценция
VJ=(FJ–Fo)/Fv	Относительная амплитуда O-J фазы
VI=(FI–FJ)/Fv	Относительная амплитуда J-I фазы
Mo=4·(F300мкс–FO)/FV	Начальный наклон фазы O-J роста флуоресценции
SM=(Area)/Fv	Площадь между кинетической кривой флуоресценции (O-J-I-P) и уровнем FM , нормированная на величину Fv
ETo/ABS= (Fv/Fm) (1–VJ)	Квантовый выход электронного транспорта
qE=(Fm–F6s)/Fv	Способность к pH-индуцированному нефотохимическому тушению флуоресценции
qPQ=(Fm–FI)/Fv	Способность пула хинонов тушить флуоресценцию

 

Флуориметр Aqua-Pen

В задаче используется портативный флуориметр AquaPen для измерения параметров быстрой индукции флуоресценции водорослей. Прибор обладает высокой чувствительностью и может быть использоваться для работы с природными водорослями.

AquaPen измеряет образцы с помощью оптического датчика. Прибор оснащен синим измеряющим светом и регистрирует флуоресценцию в красной области спектра.

AquaPen измеряет следующие параметры флуоресценции хлорофилла:

Fo и Fm – постоянная и максимальная флуоресценция у адаптированного к темноте образца при одиночном освещении односекундным импульсом мощного белого света; Fo' и Fm' – постоянная и максимальная флуоресценция после продолжительного освещения; Ft – квазистационарный уровень флуоресценции у адаптированного к свету листа;

Ft эквивалентно Fо, если образец адаптирован к темноте .

QY - квантовый выход фотосистемы 2 (QY=(Fm'-Ft)/Fm'). В темно-адаптированных образцах QY соответствует Fv / Fm.

OD – Оптическая плотность при 680 нм характеризует поглощение хлорофилла а и рассеяние света. Оптическая плотность при 720 нм представляет собой рассеяние света.

NPQ – нефотохимическое тушения флуоресценции.

OJIP - кинетика индукции флуоресценции хлорофилла во время воздействия на образец светом высокой освещенности.

Обозначения источников света :

ML (measuring pulse) - измеряющий свет. Слабый импульсный свет, не вызывающий фотохимических реакций (интегральная плотность потока фотонов - 0,2 - 1 мкмоль фотонов м^-2с^-1, длительность импульсов 1-3 мкс, частота - от 1,6 до 600 кГц в зависимости от режима записи и типа прибора).

AL(actinic light) - действующий (актиничный) свет, поддерживающий фотосинтез.

SP (super pulse) - короткие вспышки насыщающего света, интенсивность которого достаточна для быстрого восстановления пула Qa (>2000 мкЕ м²с, длительность вспышки 0,8-2 с).

В расширенном варианте возможно использование прибора (HansaTech, Англия, http://www.hansatech-instruments.com). Этот прибор позволяет проводить одновременную регистрацию индукции быстрой и замедленной флуоресценции, а также поглощения при длине 820 нм в отраженном модулированном свете, отражающего изменения Р₇₀₀- пигмента реакционного центра фотосистемы 1.

Регистрация быстрой и замедленной флуоресценции производится при чередовании актиничного света (627 нм, 5000 μE/м²с) и темновых интервалов. Прибор измеряет индукционные кривые кинетики с высоким временным разрешением (начиная с 0,01 мс), а длительность темновых интервалов может составлять 0,1 мс; актиничное освещение может быть прервано в любое время в ходе индукции флуоресценции (при записи до 300 с), а самый ранний темновой интервал можно включить при 0,3 мс. В качестве источника света используется сфокусированный ультра-яркий светодиод LED со светофильтром, пропускающий свет при длине волны 625 нм (± 25 нм). Спектральная полуширина 20 нм. Максимальная интенсивность – 5000 μE/м²с. Детектором флуоресценции является широкополосный лавинный PIN фотодиод с полосным светофильтром 730 нм (± 15 нм). Низкий уровень шума PIN фотодиода позволяет измерять ЗФ. Вес прибора 1,4 кг.

 

Описание порядка выполнения измерений