Введение

Большинство веществ, входящих в состав промышленных и бытовых стоков, способны оказывать токсическое действие на микроводоросли. В связи с этим водорослевые биотесты входят в число основных при нормировании качества вод: «Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов», Минприроды РФ, 2002;

В современной практике широко используются стандартизированные методы биотестирования на пресноводных зеленых микроводорослях рода Chlorella и Scenedesmus, культивируемых по общепринятой методике. Основными показателями токсического действия служат рост и выживаемость культуры. Между тем оценка токсичности вод и в особенности питьевой воды по реакции фотосинтетического биотеста с использованием флуоресценции является чрезвычайно актуальна. Флуориметры позволяют регистрировать параметры флуоресценции хлорофилла культур водорослей и быстро обнаруживать в водной среде появление токсических веществ. Преимущества использования флуоресценции связаны с быстротой, низкой трудоемкостью процесса измерения, а так же с ее высокой чувствительностью к действию токсикантов, поскольку она отражает состояние фотосинтетического аппарата водорослей, являющегося мишенью для многих веществ. Регистрация на свету первичных изменений фотосинтетического аппарата, наиболее чувствительного к повреждающим воздействиям, позволяет сократить время инкубации до 1-3 часов, по сравнению с 1-10 сутками при оценке токсичности по снижению скорости роста. Испытания метода на ряде модельных токсикантов (ионы Cu, Hg, Cd, Cr, Zn, гербициды и др.) показали, что чувствительность его находится на уровне ПДК для этих веществ. Методика выполнения измерений обеспечивает выполнение измерений с низкой погрешностью. Учитывая кратковременность экспериментов и предусмотренную методикой возможность жесткого контроля за условиями проведения опытов, разброс измеряемых параметров в повторах относительно низкий.

В настоящее время флуоресцентные методы включены в методы биотестирования «Методика определения токсичности вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей. » ФР.1.39.2007.03223. / Н.С.Жмур, Т.Л. Орлова // М., «Акварос»2007. и биомониторинга для контроля качества природных вод «Методика измерений обилия и индикации изменения состояния фитопланктона в природных водах флуоресцентным методом »// Маторин Д.Н., Осипов В.А., Рубин А. Б. и др. ФР.1.39.2011.11246, ПНДФ14.2.268-2012.М., .: Альтрекс. 2012. 35 с.

Применение флуоресценции водорослей в качестве биосенсоров, по-видимому, может быть с успехом использовано для тестирования тяжелых металлов. Соли тяжелых металлов занимают особое положение среди загрязнений внешней среды, что связано с их высокой токсичностью, способностью накапливаться в организмах и передаваться по трофической цепи. Действие металлов различно и зависит от природы металла, типа соединения, в котором он существует в природной среде, а также его концентрации. К возможным источникам загрязнения биосферы тяжелыми металлами относят предприятия черной и цветной металлургии (аэрозольные выбросы, загрязняющие атмосферу, промышленные стоки, загрязняющие поверхностные воды), заводы машиностроения (гальваника, никелирование, хромирование), заводы по переработке аккумуляторных батарей, автомобильный транспорт.

Тяжелые металлы попадая в живой организм, часто приводят к его отравлению или гибели. По токсичности можно выделить приоритетную группу- кадмий, медь, мышьяк, никель, ртуть, свинец, цинк и хром как наиболее опасные для здоровья человека и животных. Тяжелые металлы, попадая в водоемы, оказывают токсическое действие на фитопланктон, который является первичным звеном в системе пищевых связей водных организмов и определяет состояние водной экосистемы в целом. Среди метаболических процессов внутри растительной клетки наиболее чувствительным к действию тяжелых металлов является фотосинтез. Исследования показывают, что по флуоресценции водорослей возможно обнаруживать разные токсичные загрязнители и, особенно, соли тяжелых металлов, при достаточно низких концентрациях.

Цель данной задачи – освоение методов флуоресцентного анализа на примере исследования токсического действия солей тяжелых металлов на микроводоросли с использованием современных методов регистрации световых и индукционных параметров флуоресценции хлорофилла.

 

Объекты исследования: В экспериментах используются культуры пресноводных одноклеточных зеленых водорослей Scenedesmus quadricauda или Chlorella pyrenoidosa.

Методы: флуоресцентные методы анализа состояния фотосинтетических организмов (световые кривые и индукционные кривые флуоресценции(JIP-тест), а также индукционные кривые замедленной флуоресценции и окислительно-восстановительные превращения Р₇₀₀- пигмента реакционного центра фотосистемы 1.

План работы:

1) Установить рабочую концентрацию водорослей в суспензии по сигналу F_t для работы в оптимальном диапазоне чувствительности приборов. Определение отношения F_v/F_m для контрольного образца для подтверждения его высокой фотосинтетической активности.

2) Разлитьсуспензию водорослей в колбы объемом 50 мл. Одну колбу оставить в качестве контрольного образца. В другие колбы добавить исследуемое вещество (соли тяжелых металлов ,например CuSO₄·5H₂O) в нужных концентрациях.

3) Провести инкубацию водорослей с CuSO₄·5H₂O в камере для культивирования и измерить параметры флуоресценции через 1, 4, 8 часов и сутки.

4) Записать данные и напечатать черновые рисунки по световым, индукционным кривым быстрой и замедленной флуоресценции и окисления Р₇₀₀ с программ для приборов.

5) Построить графики по световым зависимостям параметров флуоресцеции (F_t, F_m´, Yield, qN, NPQ, rETR) и рассчитать параметры световой кривой относительной скорости нециклического электронного транспорта (коэффициент максимальной утилизации световой энергии (угол наклона световой кривой, α), максимальную относительную скорость электронов по электрон транспортной цепи (rETR_max) и насыщающую интенсивность света (Е_н).

6) Построить и рассчитать параметры индукционных кривых флуоресценции (расчет по JIP-тесту).

7) Построить кривые замедленной флуоресценции и окисления Р_700, полученные на приборе М-РЕА2.

8) Применить различные программные пакеты для обработки полученных результатов.

9) Сделать выводы по проделанной работе;