Оценка функционального состояния фагоцитов

Наиболее доступным объектом для оценки функционального состояния фагоцитов являются нейтрофилы крови. Оценку активности Fc и С3-рецепторов нейтрофилов можно проводить с помощью реакции розеткообразования с зимозаном, нагруженным соответственно анти-Fс-антителами или комплементом при 4ºС. Этот прием позволяет определить долю нейтрофилов, способных к адгезии объекта фагоцитоза.

Саму фагоцитарную активность оценивают с помощью методов, позволяющих определить долю клеток, способных формировать фагосому. "Переваривающую " способность нейтрофилов и их антибактериальную активность можно определить непосредственно методом фагоцитоза с перевариванием тестируемого микроорганизма. Для постановки реакции фагоцитоза к 1 мл суспензии фагоцитов, к которому было добавлено 8 МЕ гепарина, приливают 1 мл суспензии бактерий. Время взаимодействия составляет обычно 30 мин. После инкубации отбирают 0,5 мл смеси, добавляют 1,5 мл 0,1% раствора желатина в растворе Хенкса, охлажденного до 0ºС, и центрифугируют 3-4 мин. при 300 g. Из осадка готовят мазки, которые окрашивают по Паппенгейму. Просматривают 200 клеток (по возможности трижды). Вычисляют процент фагоцитоза. По числу содержащихся в клетках бактерий рассчитывают индекс активности фагоцитоза: число фагоцитированных бактерий умножают на процент фагоцитирующих клеток; интенсивность фагоцитоза выражают числами от1 до 4.

Степень 1: фагоцитировано 1-4 бактерий.

Степень 2: фагоцитировано 5-7 бактерий.

Степень 3: фагоцитировано 8-10 бактерий.

Степень 4: фагоцитировано более 10 бактерий на клетку.

 

Пример проведения расчета при слабом фагоцитозе.

Число просчитанных клеток 500

Число нефагоцитировавших клеток 350

Число клеток, фагоцитировавших 1-2 микроба 104

Число клеток, фагоцитировавших 3-4 микроба 40

Число клеток, фагоцитировавших 5 и более микробов 7

Индекс фагоцитоза 104 х 1,5 = 156

40 х 3,5 = 140

7 х 5 = 35

331

331 : 500 = 0,7

Количество живых микробов определяют по рассеву на плотные питательные среды 0,1 мл исследуемых фракций. Инкубируют 24(48) часов. При расчете бактерицидности исходят из того, что одна образовавшаяся колония соответствует одному живому микробу.

Для направленного изучения бактерицидности исследуют кровь пациентов и здоровых доноров с добавлением раствора антибиотиков (по 5000 ЕД пенициллина и стрептомицина/мл) и без него, а также проводят бактериальный контроль.

Состав пробы: 0,3 мл раствора Хенкса +

0,1 мл нормальной сыворотки, полученной из крови, взятой у пяти доноров +

0,5 мл суспензии лейкоцитов (10⁷ кл/мл) +

0,1 мл суспензии микробов (10⁶ мкб/мл).

Раствор антибиотиков вносят по 0,02 мл в пробу. Инкубируют пробы при 37^оС и определяют число микробов через 20 минут, 1,5 часа и 3 часа. Для этого отбирают по 0,1 мл из каждой пробы, разводят отобранные аликвоты раствором Хенкса в 10, 100 и 1000 раз и наносят на подогретый агар. Если хотят сократить длительность бактериологического исследования, можно определять находящиеся внутри клетки микробы по флуоресценции при помощи окраски акридиновым желтым.

Процесс фагоцитоза можно исследовать in vivo. Для этого белым мышам вводят внутрибрюшинно 3 мл стерильного МПБ, через 2-4 часа – 1 мл микробной взвеси S.saprophyticus в изотоноческом растворе хлорида натрия по стандарту, содержащему 2 млрд. микробных клеток в 1 мл. Через 10, 30, 60 минут после этого брюшную стенку мыши прокалывают тонким капилляром пастеровской пипетки, набирают в нее несколько капель экссудата и делают мазки на стеклах, предварительно обезжиренных в смеси Никифорова. Мазки высушивают, фиксируют в смеси Никифорова 10 минут, окрашивают по Романовскому-Гимза 30 минут. При микроскопии отмечают отдельные стадии фагоцитарного процесса: прилипание, поглощение, частичное переваривание. Подсчитывают индекс фагоцитоза в динамике. Если он со временем убывает, то это свидетельствует о том, что фагоциты переваривают поглощенные ими клетки ( завершенный фагоцитоз ). Если индекс фагоцитоза с течением времени не изменяется или возрастает, то это свидетельствует о незавершенном фагоцитозе.

В последние годы большое распространение получили методы оценки АФК (активные формы кислорода) в НСТ-тесте или с помощью хемолюминесценции. Методы основаны на способности ассоциированных с плазматической мембраной оксидаз восстанавливать кислород с образованием супероксид-анионов или перекиси водорода. Есть основание предполагать, что активация кислородного обмена может служить индикатором процесса захвата.

Для проведения НСТ-пробы - пробы на восстановление нитросинего тетразолиевого до формазана смешивают 0,1 мл крови 0,1 мл 0,1% раствора НСТ в 0,15М NaCl, инкубируют 20 минут при 37^оС, еще раз тщательно перемешивают. Включение формазана в клетки определяют микроскопией. Результат выражают в процентах формазан-позитивных клеток. Формазан-позитивными клетками считаются клетки с гранулами и включениями синего цвета. Миграционную активность фагоцитов оценивают в тестах РТМЛ и направленного хемотаксиса.