Задания к лабораторному занятию

1. Определить частоту спонтанных мутаций в культуре кишечной палочки с помощью флюктуационного теста Лурия и Дельбрюка.

2. Определить частоту трансформации в культуре стрептомицинчувствительных сенных палочек.

Тема: Действие факторов внешней среды на микроорганизмы

Цель: Знать влияние факторов внешней среды (физических, химических, биологических) на микроорганизмы; владеть вопросами асептики, антисептики, дезинфекции, стерилизации; характеризовать методы стерилизации, уметь определять эффективность дезинфицирующих средств, проводить выделение микробов-антагонистов, бактериофагов и определять их активность.

Вопросы для самоподготовки

1. Оптимальные, минимальные и максимальные температуры для жизнедеятельности грибов, дрожжей, бактерий.

2. Термофильные, мезофильные и психрофильные бактерии.

3. Влияние физических факторов на различные микроорганизмы и их споры

4. Влияние химических веществ на микроорганизмы.

5. Влияние биологических факторов на микроорганизмы.

6. Определение понятий: асептика, антисептика, дезинфекция.

7. Характеристика дезинфицирующих и антисептических средств.

8. Стерилизация. Методы стерилизации.

9. Характеристика термических методов стерилизации.

10. Химические методы стерилизации.

11. Стерилизация фильтрованием.

12. Радиационный метод стерилизации.

Литература

1. Дикий И.Л., Холупяк И.Ю., Шевелева Н.Е., Стегний М.Ю. Микробиология. – Х.: Прапор, Издательство УкрФА, 1999. – С. 136-142.

2. Н.П.Елинов, Н.А.Заикина, И.П.Соколова. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Медицина, 1988. – С. 62-72.

Жизнь микроорганизмов находится в тесной зависимости от условий внешней среды. Физические, химические и биологические факторы внешней среды могут оказывать различное влияние на микроорганизмы в зависимости от дозы, времени их воздействия, физиологического состояния и концентрации микробных клеток, среды их обитания. Изучение законов взаимоотношений между миром микробов и окружающей средой имеет большое практическое значение.

Действие физических факторов. Среди физических факторов особое значение в жизни микроорганизмов имеет температура. Жизнедеятельность микроорганизмов проявляется только при определенных температурных условиях. Различают три кардинальные температурные точки: минимум, оптимум и максимум. Между нижним и верхним пределами возможна жизнедеятельность микробов, а оптимум соответствует физиологической норме для данного вида.

Высокие температуры оказывают губительное действие на микроорганизмы, так как они вызывают коагуляцию белка цитоплазмы микробной клетки. Большинство вегетативных форм бактерий погибает уже при 10-ти минутном воздействии температуры 70ºС и моментально при температуре 100ºС. Большой устойчивостью к высоким температурам обладают бактериальные споры. Они могут сохранять способность к прорастанию даже после многочасового кипячения и только при температуре пара 120ºС и сухого жара 165-170ºС они погибают.

На действии высоких температур основан целый ряд методов стерилизации.

Высокие дозы излучения убивают большинство патогенных организмов. К ним относятся прямые солнечные лучи, ультрафиолетовые, лучи Рентгена, радия и др. Ультрафиолетовые лучи в диапазоне длины волны от 200 до 280 мкм обладают бактерицидным действием и используются в основном для дезинфекции воздуха.

Ультразвуковые волны с частотой колебаний 20000 Гц в сек и больше являются бактерицидными. Ультразвук используют для приготовления вакцин.

Аэроионы, заряженные отрицательно, убивают бактерии в концентрациях 5×10⁴ в 1 см³ воздуха, аэроионы, несущие положительные заряд, задерживают их рост только в больших концентрациях.

Действие химических факторов. Бактерицидное действие химических веществ имеет большое практическое значение, поскольку их используют для дезинфекции, антисептики и в качестве консервантов.

Дезинфекция – уничтожение в (на) каком-либо объекте или в окружающей среде патогенных микроорганизмов, вызывающих инфекционные болезни. Цель дезинфекции – прервать пути передачи и распространения инфекционного заболевания.

В качестве дезинфицирующих средств применяют галоиды, окислители, фенолы и их производные, тяжелые металлы, кислоты, щелочи, спирты, ПАВ, газообразные вещества.

Выбор дезинфицирующего вещества и длительность его воздействия диктуются как особенностями микроорганизма, так и средой, в которой будет происходить контакт дезинфицирующего вещества с патогенным микроорганизмом.

Наряду с дезинфицирующими в медицинской практике широко применяются антисептические средства (антисептики). Антисептика обозначает использование химических веществ (антисептиков), убивающих или подавляющих размножение болезнетворных и др. микроорганизмов, находящихся на коже и слизистых оболочках макроорганизма. Антисептика совместно с асептикой широко используются в хирургии.

Антисептика – комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания микроорганизмов на (в) какой-либо объект: операционное поле, бактериологический бокс, определенные производственные помещения, стерильный раствор или препарат. Работа микробиологов, хирургов и многих работников, связанных с изготовлением и использованием лекарственных средств, проводится с применением методов асептиков. Создание асептических условий предусматривает дезинфекцию помещений, стерилизацию инструментов и материалов.

Для испытания эффективности действия дезинфицирующих средств применяют метод – ”тест-объектов”.

Приготовление бактериальных тестов производят следующим образом: выстиранная белая хлопчатобумажная ткань обрабатывается спиртом в течение 30 мин. Ткань, обеззараженную таким образом, прополаскивают, сушат, проглаживают, разрезают на правильные прямоугольники длиной в 1 см, шириной 0,5 см, укладывают по 20-30 шт. в чашки Петри и стерилизуют.

Тесты заражают 2-миллиардной микробной взвесью, для чего используют смывы односуточной агаровой культуры стафилококка, кишечной палочки и антракоида (с большим содержанием спор). Стерильные кусочки ткани погружают в микробную взвесь на 20-25 минут, после этого извлекают стерильным пинцетом, просушивают между листами стерильной фильтрованной бумаги, а затем 15-20 минут в термостате.

Тесты помещают в пробирки, содержащие по 5 мг дезинфектантов и выдерживают от 5 минут до часа. После этого их дважды промывают в стерильной воде, погружают в пробирку с питательным бульоном и ставят в термостат (для стафилококка и кишечной палочки на 6-8 дней, для антракоида на 21 день). Помутневший бульон высевают на питательный агар. Для каждой экспозиции используют не менее 3 тестов. Контрольные тесты не обрабатываются дезинфицирующими веществами.

Консерванты – это вещества, обладающие антимикробным действием, которые добавляют в лекарственные средства для предотвращения роста и развития микроорганизмов, попадающих в них во время технологического процесса или при неоднократном употреблении препарата.

Консерванты вводят как в стерильные препараты (парентеральные, офтальмологические и некоторые другие), так и в нестерильные лекарственные средства.

Для максимальной защиты пациента эффективная концентрация консерванта в готовом препарате должна быть значительно ниже токсичной для человека дозы.

Испытание состоит из искусственного заражения лекарственного средства суспензиями определенных тест-микроорганизмов, инкубации контаминированных образцов при определенной температуре, отбора проб через указанные интервалы времени и подсчета жизнеспособных клеток микроорганизмов в 1 г или в 1 мл препарата на протяжении периода испытания.

Предлагаемый метод определения эффективности консервантов применяется для готовых лекарственных средств в неповрежденной упаковке.

Все лекарственные средства, в которые вводятся консерванты, разделены на две категории (Таблица 1).

Категория 1 – водорастворимые лекарственные средства, различающиеся по методу применения.

Категория 2 – нерастворимые в воде лекарственные средства.

Тест-микроорганизмы. Антимикробное действие консервантов определяют в отношении некоторых видов бактерий и грибов, которые являются наиболее частыми контаминантами лекарственных средств: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ГИСК 453 (взамен АТСС 9027), Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р, Candida albicans NCTC 885-653, Aspergillus niger BKM F-1119.

Примечание:

1. Помимо вышеперечисленных тест-штаммов можно использовать и другие культуры микроорганизмов из отечественных и зарубежных коллекций, типичные по культурально-морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам.

2. Набор тест-микроорганизмов может быть уменьшен или расширен в зависимости от применения или состава испытуемого лекарственного средства.

Подготовка тест-штаммов. Все культуры микроорганизмов, полученные из Государственных музеев, следует оживлять согласно прилагаемым инструкциям. По рекомендациям Государственного музея патогенных бактерий (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) тест-штаммы хранят при температуре 5±10 ºС в лиофилизированном состоянии или под слоем стерильного вазелинового масла на среде Романова следующего состава: панкреатического гидролизата казеина – 8,0 г, натрия хлорида – 5,0 г, агар-агара – 10,0 г, воды дистилированной – 1000 мл, рН после стерилизации 7±0,1.

Тест-штаммы бактерий из ампул с лиофилизированной культурой или со среды хранения высевают в пробирки с питательным бульоном и инкубируют посевы при температуре от 30 до 35 ºС в течение 18-24 ч.

После 2-х, 3-х пассажей с бульона на бульон культуру пересевают бактериологической петлей штрихом на питательный агар в чашках Петри для получения изолированных колоний. Условия выращивания тест-микроорганизмов приведены в таблице 2.

Выросшую на питательном агаре культуру каждого тест-штамма проверяют визуально на чистоту роста, изучают культурально-морфологические и биохимические свойства. Типичные колонии пересевают в пробирки на скошенный агар того же состава и инкубируют, как было указано выше.

Культуры грибов C.albicans и A.niger хранят при температуре 5±10 ºС на скошенном агаре Сабуро, делая пересевы каждые 3 месяца.

Приготовление инокулята. Выросшие культуры тест-штаммов бактерий и C.albicans смывают с поверхности скошенного агара стерильным 0,9% раствором натрия хлорида. Концентрацию клеток бактерий и C.albicans доводят до 10 единиц в 1 мл, используя отечественный стандартный образец мутности ОСО 42-28-59-85 или международный стандарт мутности (The International Reference Preparation of Opacity of 10 International Units). Можно для этой цели использовать инструментальный турбодиметрический метод.

Для смыва конидий A.niger используют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, содержащий 0,05% Твина-80. Количество конидий A.niger в 1 мл смыва определяют с помощью камеры Горячева. Полученную взвесь разводят до концентрации 1x10⁹ конидий в 1 мл. Стандартизованные суспензии всех тест-штаммов разводят до 1x10⁸ КОЕ/мл (КОЕ – колониеобразующая единица).

Техника испытания. Отбирают препараты в конечной, неповрежденной упаковке. В 5 стерильных флаконов помещают по 20 мл исследуемого препарата. В каждый флакон вносят по 0,1 мл одного из приготовленных инокулятов тест-микроорганизмов – E.coli, P.aeruginosa, S.aureus, C.albicans, A.niger – и перемешивают.

Лекарственные средства, нерастворимые в воде (Категория 2), контаминируют так же, как и водорастворимые препараты, из расчета конечной концентрации тест-микроорганизма 1x10⁵ – 1x10⁶ КОЕ в 1 мл или 1 г.

Препараты, приготовленные на твердой мазевой основе, нагревают до температуры от 45 до 50 ºС. Используя стерильные стеклянные бусы или шпатель, смешивают каждый инокулят стандартизованной микробной суспензии с образцом препарата в течение не менее 1 минуты до достижения гомогенной эмульсии. Для улучшения смешивания можно добавить стерильное поверхностно-активное вещество, если оно не влияет на жизнеспособность микроорганизмов или на эффективность консерванта.

Фактическую исходную концентрацию тест-микроорганизмов в контаминированных образцах определяют сразу после контаминации чашечным агаровым методом посева на соответствующие питательные среды, используя подходящие разведения для получения на чашке от 30 до 300 колоний бактерий и от 10 до 100 колоний грибов. Можно также применять для этой цели метод мембранной фильтрации.

Контаминированные образцы препарата выдерживают при температуре от 20 до 25 ºС в защищенном от света месте. Через 7, 14 и 28 суток после инокуляции определяют количество жизнеспособных микроорганизмов в 1 мл образца.

Результаты испытания и их интерпретация. Чашечным агаровым методом определяют количество КОЕ/мл для каждого тест-микроорганизма через указанные выше сроки инкубации контаминированного препарата. Выражают в десятичных логарифмах изменение количества микробных клеток по сравнению с исходной концентрацией в 1 мл. Для оценки эффективности антимикробного действия консервантов используют критерии, указанные в таблице 3.

Действие биологических факторов. Микробный антагонизм.

Во внешней среде микроорганизмы существуют в виде сложных ассоциаций. Они постоянно вступают друг с другом в сложные взаимоотношения, которые могут носить характер взаимопомощи-симбиоза или антагонизма.

Антагонизм может проявляться в бактериостатическом, бактериолитическом или бактериоцидном действии. Проявления и механизм микробного антагонизма могут быть весьма различными. Антагонизм может быть обусловлен прямым воздействием микроорганизмов друг на друга или действием их продуктов обмена. Антимикробным действием могут обладать различные неспецифические продукты обмена микробной клетки: кислоты, щелочи, спирты, перекиси, сероводород и др. соединения. Эти вещества действуют на микробную клетку неспецифически. Наибольший интерес представляют вырабатываемые микроорганизмами химические вещества, обладающие специфическим антимикробным действием, то есть действующим только на определенные виды микроорганизмов.

Для суждения об активности бактериофага определяют его титр. Титром фага называется его предельное разведение, вызывающее полный лизис соответствующей культуры. Определение титра фага можно производить на жидких и плотных питательных средах.

Выделение микробов-антагонистов из почвы производят методом ”скученных пластинок”. С этой целью густую взвесь почвы сеют на поверхность мясо-пентонного агара в чашки Петри. На фоне скученного роста более отчетливо проявляется действие микробов-антагонистов и микробов-синергистов. Вокруг первых колоний наблюдаются зоны задержки роста, вокруг вторых – пышный рост бактерий. Микробы-антагонисты и продукты их жизнедеятельности практически используют для угнетения или задержки роста гнилостных и патогенных бактерий. Микробы-антагонисты встречаются среди грибов (пенициллы, аспергиллы) и среди бактерий. Выраженными антагонистическими свойствами обладают кишечная и синегнойная палочки, молочнокислые бактерии. Так синегнойная палочка является антагонистом брюшно-тифозной и дифтерийной палочек, холерного вибриона, гнилостные бактерии-антагонисты сибиреязвенной палочки.

Испытание активности микроба-антагониста производится следующим образом. Засевают густым газоном две чашки Петри с мясо-пентонным агаром культурами кишечной палочки и стафилококка. Для этого 2-3 капли бульонной культуры этих микроорганизмов тщательно растирают по поверхности агара при помощи стерильного шпателя. На поверхность засеянных чашек накладывают кусочек агаровой культуры актиномицета-антагониста. Чашки помещают в термостат. Вокруг наложенного кусочка культуры актиномицета-антагониста наблюдается зона, свободная от роста испытуемого микроба.

Бактериофагия.

Бактериофаг является вирусом, паразитирующим в бактериальной клетке и вызывающим ее лизис. Фаги широко распространены в природе и встречаются всюду, где имеются бактерии. В природе существует огромное количество фагов строго специфичных в отношении определенных видов бактерий. Бактериофаги можно обнаружить в различных объектах внешней среды, например, сточных водах, испражнениях и др.

Феномен бактериофагии может быть изучен на жидких и плотных средах.

Наиболее показательное проявление бактериофагии – это полное просветление бульонной культуры, наступающее вследствие лизиса бактерий.

При нанесении бактериофага на агаровую культуру наблюдается образование так называемых негативных колоний или стерильных пятен.

Метод выделения бактериофага. Берут 1-2 г испражнений или др. материала, размешивают в 50 мл МПБ и ставят в термостат на 18-24 часа при 37ºС. После этого смесь для очищения от грубых частиц фильтруют через асбестовые пластинки Зейтца.

Литическую силу фильтрата по отношению к той или иной культуре микроорганизмов испытывают несколькими способами.

1. Четыре пробирки с МПБ засевают молодой культурой микроорганизмов. В первую пробирку добавляют 1 каплю, во вторую 10 капель и в третью 2 мл фильтрата. Четвертая пробирка служит контролем. После 12-18-часового инкубирования в термостате учитывают результаты. Если во всех пробирках, кроме контрольной, рост отсутствует, то выделенный бактериофаг очень активен; если бульон в пробирках с фильтратом менее мутен, чем в контрольной пробирке, или в третьей пробирке прозрачен, то выделен бактериофаг средней активности; если же все пробирки одинаково мутны, то бактериофаг в фильтрате отсутствует.

2. 12-18-часовую культуру бактерий наносят на агар в чашке Петри и растирают шпателем по всей поверхности агара так, чтобы получить сплошной рост. Подсушивают в термостате 30-45 минут, затем добавляют каплю испытуемого фильтрата, растирают его по агару и ставят чашку в термостат на 18-24 часа. При наличии в фильтрате бактериофага в культуре будут видны стерильные пятна.

3. На подсушенную поверхность агара в чашке Петри помещают каплю бульонной культуры микроорганизмов и растирают ее шпателем. Затем наносят на агар каплю испытуемого фильтрата и, наклоняя чашку, дают ему стечь в одном направлении. Ставят чашку в термостат на 18-24 часа. Если по ходу стекания капли роста не будет, то в фильтрате присутствует бактериофаг.

Метод титрования бактериофага в жидкой питательной среде.

Необходимо приготовить ряд пробирок, содержащих по 4,5 мл МПБ. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 мл исходного бактериофага (разведение 1:10). Из первого разведения новой стерильной пипеткой 0,5 мл переносят во 2-ю пробирку (разведение 1:100). И таким образом проводят разведение в девяти пробирках. Десятую пробирку оставляют для контроля, т.е. она не должна содержать фага. Во все пробирки, включая контрольную, вносят по одной капле бульонной культуры микроорганизма. Пробирки термостатируют 18-24 часа и после этого производят учет результатов.